Immunmodulerende metabolitter er et centralt træk ved tumormikromiljøet (TME), men med få undtagelser forbliver deres identiteter stort set ukendte. Her analyserede vi tumorer og T-celler fra tumorer og ascites hos patienter med højgradig serøs karcinom (HGSC) for at afsløre metabolomet i disse forskellige TME-kompartments. Ascites- og tumorceller har omfattende forskelle i metabolitter. Sammenlignet med ascites er de tumorinfiltrerende T-celler signifikant beriget med 1-methylnicotinamid (MNA). Selvom niveauet af MNA i T-celler er forhøjet, er ekspressionen af ​​nicotinamid-N-methyltransferase (et enzym, der katalyserer overførslen af ​​methylgrupper fra S-adenosylmethionin til nicotinamid) begrænset til fibroblaster og tumorceller. Funktionelt inducerer MNA T-celler til at udskille det tumorfremmende cytokin tumornekrosefaktor alfa. Derfor bidrager TME-afledt MNA til immunreguleringen af ​​T-celler og repræsenterer et potentielt immunterapimål til behandling af human kræft.
Tumorafledte metabolitter kan have en dybtgående hæmmende effekt på antitumorimmunitet, og flere og flere beviser viser, at de også kan tjene som en central drivkraft for sygdomsprogression (1). Ud over Warburg-effekten er nyere arbejde begyndt at karakterisere tumorcellers metaboliske tilstand og dens forhold til immuntilstanden i tumormikromiljøet (TME). Studier af musemodeller og humane T-celler har vist, at glutaminmetabolisme (2), oxidativ metabolisme (3) og glukosemetabolisme (4) kan virke uafhængigt på forskellige immuncelleundergrupper. Adskillige metabolitter i disse signalveje hæmmer T-cellernes antitumorfunktion. Det er blevet bevist, at blokaden af ​​coenzymet tetrahydrobiopterin (BH4) kan skade proliferationen af ​​T-celler, og stigningen i BH4 i kroppen kan forstærke antitumorimmunresponset medieret af CD4 og CD8. Derudover kan den immunsuppressive effekt af kynurenin genoprettes ved administration af BH4 (5). I isocitratdehydrogenase (IDH)-mutant glioblastom hæmmer sekretionen af ​​enantiometabolisk (R)-2-hydroxyglutarat (R-2-HG) T-celleaktivering, proliferation og cytolyseaktivitet (6). For nylig er det blevet vist, at methylglyoxal, et biprodukt af glykolyse, produceres af suppressorceller af myeloid oprindelse, og T-celleoverførsel af methylglyoxal kan hæmme effektor-T-cellefunktionen. Ved behandling kan neutralisering af methylglyoxal overvinde aktiviteten af ​​myeloid-afledte suppressorceller (MDSC) og synergistisk forbedre checkpoint-blokadebehandling i musemodeller (7). Disse studier understreger samlet set den centrale rolle, som TME-afledte metabolitter spiller i reguleringen af ​​T-cellefunktion og -aktivitet.
T-celledysfunktion er blevet rapporteret bredt i forbindelse med ovariecancer (8). Dette skyldes delvist de metaboliske karakteristika, der er forbundet med hypoxi og unormal tumorvaskulatur (9), hvilket resulterer i omdannelsen af ​​glukose og tryptofan til biprodukter såsom mælkesyre og kynurenin. Overdreven ekstracellulær laktat reducerer produktionen af ​​interferon-γ (IFN-γ) og driver differentieringen af ​​myelosuppressive undergrupper (10, 11). Indtagelse af tryptofan hæmmer direkte T-celleproliferation og hæmmer T-cellereceptorsignalering (12-14). På trods af disse observationer blev der udført en masse arbejde omkring immunmetabolisme i in vitro T-cellekultur ved hjælp af optimerede medier eller begrænset til homologe musemodeller in vivo, hvoraf ingen fuldt ud afspejler heterogeniteten af ​​humane kræftformer og det fysiologiske makro- og mikromiljø.
Et almindeligt træk ved æggestokkræft er spredning i bughulen og forekomsten af ​​ascites. Ophobning af cellevæske i ascites er forbundet med fremskreden sygdom og dårlig prognose (15). Ifølge rapporter er dette unikke rum hypoksisk, har høje niveauer af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og indoleamin 2,3-dioxygenase (IDO) og er infiltreret af T-regulatoriske celler og myeloide inhiberende celler (15-18). Ascites' metaboliske miljø kan være forskelligt fra selve tumorens, så omprogrammeringen af ​​T-celler i det peritoneale rum er uklar. Derudover kan de vigtigste forskelle og heterogenitet mellem ascites og metabolitter, der er til stede i tumormiljøet, hæmme infiltrationen af ​​immunceller og deres funktion på tumorer, og yderligere forskning er nødvendig.
For at løse disse problemer har vi designet en følsom celleseparations- og væskekromatografi-tandemmassespektrometri (LC-MS/MS)-metode til at studere forskellige celletyper (inklusive CD4+ og CD8+ T-celler) samt inden for og mellem tumorer. Dens metabolitter spænder over celler i samme ascites- og tumormiljø som patienten. Vi bruger denne metode i forbindelse med højdimensionel flowcytometri og enkeltcelle-RNA-sekventering (scRNA-seq) for at give et meget opløst portræt af den metaboliske status hos disse nøglepopulationer. Denne metode afslørede en signifikant stigning i niveauet af 1-methylnicotinamid (MNA) i tumor-T-celler, og in vitro-eksperimenter viste, at den immunmodulerende effekt af MNA på T-cellefunktionen tidligere var ukendt. Generelt afslører denne metode de gensidige metaboliske interaktioner mellem tumorer og immunceller og giver unik indsigt i immunreguleringsmetabolitter, hvilket kan være nyttigt til behandling af T-cellebaseret ovariecancer-immunterapi. Behandlingsmuligheder.
Vi anvendte højdimensionel flowcytometri til samtidig at kvantificere glukoseoptagelse [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) og mitokondrieaktivitet [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) er typiske markører side om side, der adskiller immunceller og tumorcellepopulationer (Tabel S2 og Figur S1A). Denne analyse viste, at ascites og tumorceller har højere glukoseoptagelsesniveauer sammenlignet med T-celler, men mindre forskelle i mitokondrieaktivitet. Den gennemsnitlige glukoseoptagelse af tumorceller [CD45-EpCAM (EpCAM)+] er tre til fire gange så stor som for T-celler, og den gennemsnitlige glukoseoptagelse af CD4+ T-celler er 1,2 gange så stor som for CD8+ T-celler, hvilket indikerer, at tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) har forskellige metaboliske krav, selv i den samme TME (Figur 1A). I modsætning hertil ligner mitokondrieaktiviteten i tumorceller CD4+ T-cellers, og mitokondrieaktiviteten for begge celletyper er højere end for CD8+ T-celler (Figur 1B). Generelt afslører disse resultater det metaboliske niveau. Tumorcellers metaboliske aktivitet er højere end CD4+ T-cellers, og CD4+ T-cellers metaboliske aktivitet er højere end CD8+ T-cellers. Trods disse effekter på tværs af celletyper er der ingen ensartet forskel i CD4+ og CD8+ T-cellers metaboliske status eller deres relative andele i ascites sammenlignet med tumorer (Figur 1C). I modsætning hertil steg andelen af ​​EpCAM+ celler i tumoren i CD45-cellefraktionen sammenlignet med ascites (Figur 1D). Vi observerede også en klar metabolisk forskel mellem EpCAM+ og EpCAM- cellekomponenter. EpCAM+ (tumor) celler har højere glukoseoptagelse og mitokondrieaktivitet end EpCAM- celler, hvilket er meget højere end fibroblasternes metaboliske aktivitet i tumorceller i TME (Figur 1, E og F).
(A og B) Median fluorescensintensitet (MFI) for glukoseoptagelse (2-NBDG) (A) og mitokondrieaktivitet af CD4+ T-celler (MitoTracker mørkerød) (B) Repræsentative grafer (venstre) og tabeldata (højre), CD8+ T-celler og EpCAM+ CD45-tumorceller fra ascites og tumor. (C) Forholdet mellem CD4+ og CD8+ celler (af CD3+ T-celler) i ascites og tumor. (D) Andel af EpCAM+ tumorceller i ascites og tumor (CD45−). (E og F) EpCAM + CD45-tumor og EpCAM-CD45-matrix glukoseoptagelse (2-NBDG) (E) og mitokondrieaktivitet (MitoTracker mørkerød) (F) Repræsentative grafer (venstre) og tabeldata (højre) Ascites og tumorceller. (G) Repræsentative grafer for CD25-, CD137- og PD1-ekspression ved flowcytometri. (H og I) CD25-, CD137- og PD1-ekspression på CD4+ T-celler (H) og CD8+ T-celler (I). (J og K) Naive fænotyper, central hukommelse (Tcm), effektor- (Teff) og effektorhukommelse (Tem) baseret på ekspressionen af ​​CCR7 og CD45RO. Repræsentative billeder (venstre) og tabeldata (højre) af CD4+ T-celler (J) og CD8+ T-celler (K) i ascites og tumorer. P-værdier bestemt ved parret t-test (*P<0,05, **P<0,01 og ***P<0,001). Linjen repræsenterer matchede patienter (n = 6). FMO, fluorescens minus én; MFI, median fluorescensintensitet.
Yderligere analyse afslørede andre signifikante forskelle mellem den højopløste fænotypiske status for T-celler. Aktiveret (Figur 1, G til I) og effektorhukommelse (Figur 1, J og K) i tumorer er meget hyppigere end ascites (andel af CD3+ T-celler). Tilsvarende viste analyse af fænotypen ved ekspression af aktiveringsmarkører (CD25 og CD137) og depletionsmarkører [programmeret celledødsprotein 1 (PD1)], at selvom de metaboliske karakteristika for disse populationer er forskellige (Figur S1, B til E), blev der ikke konsekvent observeret signifikante metaboliske forskelle mellem naive, effektor- eller hukommelsesundergrupper (Figur S1, F til I). Disse resultater blev bekræftet ved hjælp af maskinlæringsmetoder til automatisk at tildele cellefænotyper (21), hvilket yderligere afslørede tilstedeværelsen af ​​et stort antal knoglemarvsceller (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) i patientens ascites (Figur S2A). Blandt alle de identificerede celletyper udviste denne myeloide cellepopulation den højeste glukoseoptagelse og mitokondrieaktivitet (Figur S2, B til G). Disse resultater fremhæver de stærke metaboliske forskelle mellem de mange celletyper, der findes i ascites og tumorer hos HGSC-patienter.
Den største udfordring i at forstå de metabonomiske karakteristika ved TIL er behovet for at isolere T-celleprøver af tilstrækkelig renhed, kvalitet og kvantitet fra tumorer. Nyere undersøgelser har vist, at sorterings- og perleberigelsesmetoder baseret på flowcytometri kan føre til ændringer i cellulære metabolitprofiler (22-24). For at overvinde dette problem optimerede vi perleberigelsesmetoden for at isolere og isolere TIL fra kirurgisk resekeret human ovariecancer før analyse ved LC-MS/MS (se Materialer og Metoder; Figur 2A). For at vurdere den samlede indvirkning af denne protokol på metabolitændringer sammenlignede vi metabolitprofilerne af T-celler aktiveret af raske donorer efter ovenstående perleseparationstrin med celler, der ikke blev perlesepareret, men forblev på is. Denne kvalitetskontrolanalyse viste, at der er en høj korrelation mellem disse to betingelser (r = 0,77), og den tekniske repeterbarhed af gruppen på 86 metabolitter har høj repeterbarhed (Figur 2B). Derfor kan disse metoder udføre nøjagtig metabolitanalyse i celler, der undergår celletypeberigelse, og dermed give den første platform med høj opløsning til at identificere specifikke metabolitter i HGSC, hvorved folk kan få en dybere forståelse af cellespecificiteten af ​​​​det seksuelle metabolismeprogram.
(A) Skematisk diagram over berigelse med magnetiske perler. Før analyse ved LC-MS/MS vil cellerne gennemgå tre på hinanden følgende runder med berigelse med magnetiske perler eller forblive på is. (B) Effekten af ​​berigelsestypen på mængden af ​​metabolitter. Gennemsnittet af tre målinger for hver berigelsestype ± SE. Den grå linje repræsenterer et 1:1-forhold. Intra-klasse korrelationen (ICC) af gentagne målinger vist i aksemærkningen. NAD, nikotinamid-adenin-dinukleotid. (C) Skematisk diagram over arbejdsgangen for patientmetabolitanalyse. Ascites eller tumorer indsamles fra patienter og kryopræserveres. En lille del af hver prøve blev analyseret ved flowcytometri, mens de resterende prøver gennemgik tre runder med berigelse for CD4+-, CD8+- og CD45--celler. Disse cellefraktioner blev analyseret ved hjælp af LC-MS/MS. (D) Varmekort over standardiseret metabolitmængde. Dendrogrammet repræsenterer Wards klyngedannelse af euklidiske afstande mellem prøver. (E) Principal component analysis (PCA) af prøvens metabolitkort, der viser tre replikater af hver prøve, hvor prøver fra den samme patient er forbundet med en linje. (F) PCA af metabolitprofilen for prøvens betingelse på patienten (dvs. ved brug af delvis redundans); prøvetypen er begrænset af den konvekse skal. PC1, hovedkomponent 1; PC2, hovedkomponent 2.
Dernæst anvendte vi denne berigelsesmetode til at analysere 99 metabolitter i CD4+-, CD8+- og CD45-cellefraktionerne i primære ascites og tumorer hos seks HGSC-patienter (Figur 2C, Figur S3A og Tabel S3 og S4). Den pågældende population tegner sig for 2% til 70% af den oprindelige store prøve af levende celler, og andelen af ​​celler varierer meget mellem patienter. Efter adskillelse af perlerne tegner den berigede fraktion af interesse (CD4+, CD8+ eller CD45-) sig for mere end 85% af alle levende celler i prøven i gennemsnit. Denne berigelsesmetode giver os mulighed for at analysere cellepopulationer fra humant tumorvævsmetabolisme, hvilket er umuligt at gøre fra store prøver. Ved hjælp af denne protokol bestemte vi, at l-kynurenin og adenosin, disse to velkarakteriserede immunsuppressive metabolitter, var forhøjede i tumor-T-celler eller tumorceller (Figur S3, B og C). Derfor demonstrerer disse resultater troværdigheden og evnen af ​​vores celleseparations- og massespektrometriteknologi til at finde biologisk vigtige metabolitter i patientvæv.
Vores analyse afslørede også en stærk metabolisk adskillelse af celletyper inden for og mellem patienter (Figur 2D og Figur S4A). Især patient 70 udviste forskellige metaboliske karakteristika sammenlignet med andre patienter (Figur 2E og Figur S4B), hvilket indikerer, at der kan være betydelig metabolisk heterogenitet mellem patienterne. Det er værd at bemærke, at den samlede mængde ascites indsamlet hos patient 70 (80 ml) var mindre sammenlignet med andre patienter (1,2 til 2 liter; Tabel S1). Kontrollen af ​​interpatientheterogenitet under principal component analyse (f.eks. ved hjælp af partial redundansanalyse) viser konsistente ændringer mellem celletyper, og celletyperne og/eller mikromiljøet er tydeligt aggregeret i henhold til metabolitprofilen (Figur 2F). Analysen af ​​enkeltmetabolitter understregede disse effekter og afslørede signifikante forskelle mellem celletyper og mikromiljø. Det er værd at bemærke, at den mest ekstreme observerede forskel er MNA, som normalt er beriget med CD45--celler og med CD4+- og CD8+-celler, der infiltrerer tumoren (Figur 3A). For CD4+-celler er denne effekt mest tydelig, og MNA i CD8+-celler synes også at være stærkt påvirket af miljøet. Dette er dog ikke vigtigt, da kun tre ud af de seks patienter kan evalueres for tumor CD8+-scorer. Ud over MNA er andre metabolitter, der er dårligt karakteriseret i TIL, også differentielt rige i forskellige celletyper i ascites og tumorer (figur S3 og S4). Derfor afslører disse data et lovende sæt af immunmodulerende metabolitter til yderligere forskning.
(A) Normaliseret indhold af MNA i CD4+, CD8+ og CD45- celler fra ascites og tumor. Boksplottet viser medianen (linje), interkvartilområdet (rammehængsel) og dataområdet, op til 1,5 gange interkvartilområdet (rammekurve). Som beskrevet i Patientmaterialer og -metoder, brug patientens limmaværdi til at bestemme P-værdien (*P<0,05 og **P<0,01). (B) Skematisk diagram over MNA-metabolisme (60). Metabolitter: S-adenosyl-1-methionin; SAH, S-adenosin-1-homocystein; NA, nikotinamid; MNA, 1-methylnikotinamid; 2-PY, 1-methyl-2-pyridon-5-carboxamid; 4-PY, 1-methyl-4-pyridon-5-carboxamid; NR, nikotinamidribose; NMN, nikotinamidmononukleotid. Enzymer (grøn): NNMT, nikotinamid-N-methyltransferase; SIRT, sirtuiner; NAMPT, nikotinamid-phosphoribosyltransferase; AOX1, aldehydoxidase 1; NRK, nikotinamid-ribosidkinase; NMNAT, nikotinamid-mononukleotid-adenylattransferase; Pnp1, purin-nukleosid-phosphorylase. (C) t-SNE af scRNA-sekvens af ascites (grå) og tumor (rød; n = 3 patienter). (D) NNMT-ekspression i forskellige cellepopulationer identificeret ved hjælp af scRNA-sekvens. (E) Ekspression af NNMT og AOX1 i SK-OV-3, humane embryonale nyre (HEK) 293T, T-celler og MNA-behandlede T-celler. Den foldede ekspression er vist i forhold til SK-OV-3. Ekspressionsmønsteret med SEM er vist (n = 6 raske donorer). Ct-værdier større end 35 betragtes som ikke-detekterbare (UD). (F) Ekspression af SLC22A1 og SLC22A2 i SK-OV-3, HEK293T, T-celler og T-celler behandlet med 8 mM MNA. Den foldede ekspression er vist i forhold til SK-OV-3. Ekspressionsmønsteret med SEM er vist (n = 6 raske donorer). Ct-værdier større end 35 betragtes som udetekterbare (UD). (G) Celle-MNA-indhold i aktiverede raske donor-T-celler efter 72 timers inkubation med MNA. Ekspressionsmønsteret med SEM er vist (n = 4 raske donorer).
MNA produceres ved at overføre methylgruppen fra S-adenosyl-1-methionin (SAM) til nikotinamid (NA) ved hjælp af nikotinamid-N-methyltransferase (NNMT; figur 3B). NNMT er overudtrykt i en række forskellige humane kræftformer og er forbundet med proliferation, invasion og metastase (25-27). For bedre at forstå kilden til MNA i T-celler i TME, brugte vi scRNA-seq til at karakterisere ekspressionen af ​​NNMT på tværs af celletyper i ascites og tumorer hos tre HGSC-patienter (tabel S5). Analyse af cirka 6.500 celler viste, at NNMT-ekspression i ascites- og tumormiljøer var begrænset til de formodede fibroblast- og tumorcellepopulationer (figur 3, C og D). Det er værd at bemærke, at der ikke er nogen tydelig NNMT-ekspression i nogen population, der udtrykker PTPRC (CD45+) (figur 3D og figur S5A), hvilket indikerer, at den MNA, der er detekteret i metabolitspektret, er blevet introduceret i T-celler. Ekspressionen af ​​aldehydoxidase 1 (AOX1) omdanner MNA til 1-methyl-2-pyridon-5-carboxamid (2-PYR) eller 1-methyl-4-pyridon-5-carboxamid (4-PYR); figur 3B) er også begrænset til populationen af ​​fibroblaster, der udtrykker COL1A1 (figur S5A), hvilket tilsammen indikerer, at T-celler mangler evnen til konventionel MNA-metabolisme. Ekspressionsmønsteret for disse MNA-relaterede gener blev verificeret ved hjælp af et andet uafhængigt celledatasæt fra ascites fra HGSC-patienter (figur S5B; n = 6) (16). Derudover viste kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse (qPCR) af raske donor-T-celler behandlet med MNA, at NNMT eller AOX1 næsten ikke blev udtrykt sammenlignet med kontrol SK-OV-3 ovarietumorceller (figur 3E). Disse uventede resultater indikerer, at MNA kan udskilles fra fibroblaster eller tumorer i tilstødende T-celler i TME.
Selvom kandidaterne omfatter familien af ​​organiske kationtransportører 1 til 3 (OCT1, OCT2 og OCT3) kodet af den opløselige carrier 22 (SLC22)-familie (SLC22A1, SLC22A2 og SLC22A3), er de potentielle transportører af MNA stadig udefinerede (28). QPCR af mRNA fra raske donor-T-celler viste lave ekspressionsniveauer af SLC22A1, men ikke-detekterbare niveauer af SLC22A2, hvilket bekræftede, at det tidligere var blevet rapporteret i litteraturen (Figur 3F) (29). I modsætning hertil udtrykte SK-OV-3-ovarietumorcellelinjen høje niveauer af begge transportører (Figur 3F).
For at teste muligheden for, at T-celler har evnen til at absorbere fremmed MNA, blev raske donor-T-celler dyrket i 72 timer i nærvær af forskellige koncentrationer af MNA. I fravær af eksogent MNA kan det cellulære indhold af MNA ikke detekteres (Figur 3G). Aktiverede T-celler behandlet med eksogent MNA viste imidlertid en dosisafhængig stigning i MNA-indholdet i cellerne, op til 6 mM MNA (Figur 3G). Dette resultat indikerer, at på trods af det lave niveau af transportørekspression og manglen på det primære enzym, der er ansvarligt for intracellulær MNA-metabolisme, kan TIL stadig optage MNA.
Spektret af metabolitter i patienters T-celler og in vitro MNA-absorptionsforsøg øger muligheden for, at kræftassocierede fibroblaster (CAF) udskiller MNA, og at tumorceller kan regulere fænotypen og funktionen af ​​TIL. For at bestemme effekten af ​​MNA på T-celler blev raske donor-T-celler aktiveret in vitro i nærvær eller fravær af MNA, og deres proliferation og cytokinproduktion blev evalueret. Efter 7 dage med tilsætning af MNA ved den højeste dosis var populationsfordoblingstallet moderat reduceret, mens vigor blev opretholdt ved alle doser (Figur 4A). Derudover resulterede behandling af eksogen MNA i en stigning i andelen af ​​CD4+ og CD8+ T-celler, der udtrykker tumornekrosefaktor-α (TNFα; Figur 4B). I modsætning hertil var den intracellulære produktion af IFN-γ signifikant reduceret i CD4+ T-celler, men ikke i CD8+ T-celler, og der var ingen signifikant ændring i interleukin 2 (IL-2; Figur 4, C og D). Derfor viste enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) af supernatanter fra disse MNA-behandlede T-cellekulturer en signifikant stigning i TNFα, et fald i IFN-γ og ingen ændring i IL-2 (Figur 4, E til G). Faldet i IFN-γ indikerer, at MNA kan spille en rolle i at hæmme T-cellers antitumoraktivitet. For at simulere effekten af ​​MNA på T-cellemedieret cytotoksicitet produceres kimære antigenreceptor T (FRα-CAR-T)-celler, der er målrettet mod folatreceptor α og CAR-T (GFP) reguleret af grønt fluorescerende protein (GFP)-CAR-T)-celler, af raske perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra donorer. CAR-T-celler blev dyrket i 24 timer i nærvær af MNA og derefter co-dyrket med humane SK-OV-3 ovarietumorceller, der udtrykker folatreceptor α i et effektor-til-mål-forhold på 10:1. MNA-behandling resulterede i et signifikant fald i FRα-CAR-T-cellernes drabsaktivitet, hvilket svarede til FRα-CAR-T-celler behandlet med adenosin (figur 4H).
(A) Totalt antal levedygtige celler og populationsfordobling (PD) direkte fra kultur på dag 7. Søjlediagrammet repræsenterer middelværdien + SEM for seks raske donorer. Repræsenterer data fra mindst n = 3 uafhængige eksperimenter. (B til D) CD3/CD28 og IL-2 blev brugt til at aktivere T-celler ved deres respektive MNA-koncentrationer i 7 dage. Før analyse blev cellerne stimuleret med PMA/ionomycin med GolgiStop i 4 timer. TNFα (B) ekspression i T-celler. Eksempelbillede (venstre) og tabeldata (højre) af TNFα-ekspression i levende celler. IFN-γ (C) og IL-2 (D) ekspression i T-celler. Ekspressionen af ​​cytokiner blev målt ved flowcytometri. Søjlediagrammet repræsenterer middelværdien (n = 6 raske donorer) + SEM. Brug envejs variansanalyse og gentagne målinger (*P<0,05 og **P<0,01) til at bestemme P-værdien. Repræsenterer data fra mindst n = 3 uafhængige eksperimenter. (E til G) CD3/CD28 og IL-2 blev brugt til at aktivere T-celler ved deres respektive MNA-koncentrationer i 7 dage. Mediet blev opsamlet før og efter 4 timers PMA/ionomycin-stimulering. Koncentrationerne af TNFα (E), IFN-γ (F) og IL-2 (G) blev målt ved ELISA. Søjlediagrammet repræsenterer middelværdien (n = 5 raske donorer) + SEM. P-værdi bestemt ved hjælp af envejs-variansanalyse og gentagne målinger (*P < 0,05). Den stiplede linje angiver detektionsgrænsen for detektionen. (H) Cellelyse-assay. FRα-CAR-T- eller GFP-CAR-T-celler blev justeret med adenosin (250 μM) eller MNA (10 mM) i 24 timer eller efterladt ubehandlede (Ctrl). Den procentvise drab af SK-OV-3-celler blev målt. P-værdi bestemt ved Welch t-test (*P < 0,5 og **P < 0,01).
For at opnå en mekanistisk forståelse af MNA-afhængig TNFα-ekspressionsregulering blev ændringerne i TNFα mRNA fra MNA-behandlede T-celler evalueret (Figur 5A). Raske donor-T-celler behandlet med MNA viste en dobbelt stigning i TNFα-transkriptionsniveauer, hvilket indikerer, at MNA er afhængig af TNFα-transkriptionsregulering. For at undersøge denne mulige reguleringsmekanisme blev to kendte transkriptionsfaktorer, der regulerer TNFα, nemlig aktiveret T-celle-nuklear faktor (NFAT) og specifikt protein 1 (Sp1), evalueret som respons på MNA-binding til den proximale TNFα-promotor (30). TNFα-promotoren indeholder 6 identificerede NFAT-bindingssteder og 2 Sp1-bindingssteder, der overlapper hinanden på ét sted [-55 basepar (bp) fra 5'-kappen] (30). Kromatinimmunpræcipitation (ChIP) viste, at bindingen af ​​Sp1 til TNFα-promotoren tredobledes ved behandling med MNA. Inkorporeringen af ​​NFAT steg også og nærmede sig betydning (Figur 5B). Disse data indikerer, at MNA regulerer ekspressionen af ​​TNFα via Sp1-transkription, og i mindre grad ekspressionen af ​​NFAT.
(A) Sammenlignet med T-celler dyrket uden MNA, ændringen i TNFα-ekspression i T-celler behandlet med MNA. Ekspressionsmønsteret med SEM er vist (n = 5 raske donorer). Repræsenterer data fra mindst n = 3 uafhængige eksperimenter. (B) TNFα-promotoren fra T-celler behandlet med eller uden 8 mM MNA efter NFAT og Sp1 blev kombineret med (Ctrl) og PMA/ionomycin-stimulering i 4 timer. Immunoglobulin G (IgG) og H3 blev anvendt som henholdsvis negative og positive kontroller til immunpræcipitation. Kvantificeringen af ​​ChIP viste, at bindingen af ​​Sp1 og NFAT til TNFα-promotoren i MNA-behandlede celler steg flere gange sammenlignet med kontrollen. Repræsenterer data fra mindst n = 3 uafhængige eksperimenter. P-værdi bestemt ved multiple t-tests (*** P <0,01). (C) Sammenlignet med ascites fra HGSC viste T-celler (ikke-cytotoksiske) øget ekspression af TNF i tumoren. Farverne repræsenterer forskellige patienter. De viste celler er blevet tilfældigt samplet til 300 og jitteret for at begrænse overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Foreslået model af MNA til ovariecancer. MNA produceres i tumorceller og fibroblaster i TME og optages af T-celler. MNA øger bindingen af ​​Sp1 til TNFα-promotoren, hvilket fører til øget TNFα-transkription og TNFα-cytokinproduktion. MNA forårsager også et fald i IFN-γ. Hæmning af T-cellefunktionen fører til reduceret drabsevne og accelereret tumorvækst.
Ifølge rapporter har TNFα front- og bagafhængige antitumor- og antitumoreffekter, men det har en velkendt rolle i at fremme vækst og metastase af æggestokkræft (31-33). Ifølge rapporter er koncentrationen af ​​TNFα i ascites og tumorvæv hos patienter med æggestokkræft højere end i godartet væv (34-36). Med hensyn til mekanisme kan TNFα regulere aktiveringen, funktionen og proliferationen af ​​hvide blodlegemer og ændre fænotypen af ​​kræftceller (37, 38). I overensstemmelse med disse fund viste differentiel genekspressionsanalyse, at TNF var signifikant opreguleret i T-celler i tumorvæv sammenlignet med ascites (Figur 5C). Stigningen i TNF-ekspression var kun tydelig i T-cellepopulationer med en ikke-cytotoksisk fænotype (Figur S5A). Sammenfattende understøtter disse data synspunktet om, at MNA har dobbelte immunsuppressive og tumorfremmende effekter i HGSC.
Fluorescensmærkning baseret på flowcytometri er blevet den primære metode til at studere TIL-metabolisme. Disse undersøgelser har vist, at murin og human TIL har en højere tendens til at optage glukose (4, 39) og et gradvist tab af mitokondriefunktion (19, 40) sammenlignet med perifere blodlymfocytter eller T-celler fra sekundære lymfoide organer. Selvom vi har observeret lignende resultater i denne undersøgelse, er den vigtigste udvikling at sammenligne metabolismen af ​​tumorceller og TIL fra det samme resekerede tumorvæv. I overensstemmelse med nogle af disse tidligere rapporter har tumorceller (CD45-EpCAM+) fra ascites og tumorer højere glukoseoptagelse end CD8+ og CD4+ T-celler, hvilket understøtter, at tumorcellers høje glukoseoptagelse kan sammenlignes med T-celler. Konceptet med T-cellekonkurrence. TME. Imidlertid er tumorcellers mitokondrieaktivitet højere end CD8+ T-cellers, men mitokondrieaktiviteten ligner CD4+ T-cellers. Disse resultater forstærker det nye tema om, at oxidativ metabolisme er vigtig for tumorceller (41, 42). De antyder også, at CD8+ T-celler kan være mere modtagelige for oxidativ dysfunktion end CD4+ T-celler, eller at CD4+ T-celler kan bruge andre kulstofkilder end glukose til at opretholde mitokondrieaktivitet (43, 44). Det skal bemærkes, at vi ikke observerede nogen forskel i glukoseoptagelse eller mitokondrieaktivitet mellem CD4+ T-effektorer, T-effektorhukommelsesceller og T-centrale hukommelsesceller i ascites. Tilsvarende har differentieringstilstanden af ​​CD8+ T-celler i tumorer intet at gøre med ændringer i glukoseoptagelse, hvilket fremhæver den signifikante forskel mellem T-celler dyrket in vitro og human TIL in vivo (22). Disse observationer blev også bekræftet ved brug af upartisk automatisk cellepopulationsallokering, hvilket yderligere afslørede, at CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ celler med højere glukoseoptagelse og mitokondrieaktivitet end tumorceller er udbredte, men har en metabolisk aktiv cellepopulation. Denne population kan repræsentere den formodede subpopulation af myeloide suppressorceller eller plasmacytoide dendritiske celler identificeret i scRNA-seq-analysen. Selvom begge disse er blevet rapporteret i humane ovarietumorer [45], kræver de stadig yderligere arbejde at beskrive denne myeloide subpopulation.
Selvom flowcytometri-baserede metoder kan afklare de generelle forskelle i glukose- og oxidativ metabolisme mellem celletyper, er de præcise metabolitter produceret af glukose eller andre kulstofkilder til mitokondriemetabolisme i TME endnu ikke blevet bestemt. Tildeling af tilstedeværelsen eller fraværet af metabolitter til en given TIL-subgruppe kræver oprensning af cellepopulationen fra det udskårne væv. Derfor kan vores celleberigelsesmetode kombineret med massespektrometri give indsigt i de metabolitter, der er differentielt beriget i T-celler og tumorcellepopulationer i matchende patientprøver. Selvom denne metode har fordele i forhold til fluorescensaktiveret cellesortering, kan visse metabolitbiblioteker blive påvirket på grund af iboende stabilitet og/eller hurtig omsætningshastighed (22). Ikke desto mindre var vores metode i stand til at identificere to anerkendte immunsuppressive metabolitter, adenosin og kynurenin, fordi de varierer meget mellem prøvetyper.
Vores metabonomiske analyse af tumorer og TIL-subtyper giver mere indsigt i metabolitternes rolle i ovarie-TME. For det første fastslog vi ved hjælp af flowcytometri, at der ikke var nogen forskel i mitokondrieaktivitet mellem tumorer og CD4+ T-celler. LC-MS/MS-analyse afslørede dog signifikante ændringer i mængden af ​​metabolitter blandt disse populationer, hvilket indikerer, at konklusioner om TIL-metabolisme og dens samlede metaboliske aktivitet kræver omhyggelig fortolkning. For det andet er MNA den metabolit med den største forskel mellem CD45-celler og T-celler i ascites, ikke i tumorer. Derfor kan kompartmentalisering og tumorplacering have forskellige effekter på TIL-metabolisme, hvilket fremhæver den mulige heterogenitet i et givet mikromiljø. For det tredje er ekspressionen af ​​det MNA-producerende enzym NNMT hovedsageligt begrænset til CAF, som i mindre grad er tumorceller, men detekterbare MNA-niveauer observeres i tumorafledte T-celler. Overekspressionen af ​​NNMT i ovarie-CAF har en kendt kræftfremmende effekt, delvist på grund af fremme af CAF-metabolisme, tumorinvasion og metastase (27). Selvom det samlede niveau af TIL er moderat, er ekspressionen af ​​NNMT i CAF tæt beslægtet med den mesenkymale subtype af Cancer Genome Atlas (TCGA), som er forbundet med dårlig prognose (27, 46, 47). Endelig er ekspressionen af ​​enzymet AOX1, der er ansvarlig for MNA-nedbrydning, også begrænset til CAF-populationen, hvilket indikerer, at T-celler mangler evnen til at metabolisere MNA. Disse resultater understøtter ideen om, at selvom yderligere arbejde er nødvendigt for at verificere dette fund, kan høje niveauer af MNA i T-celler indikere tilstedeværelsen af ​​et immunsuppressivt CAF-mikromiljø.
I betragtning af det lave ekspressionsniveau af MNA-transportører og de ikke-detekterbare niveauer af nøgleproteiner involveret i MNA-metabolisme, er tilstedeværelsen af ​​MNA i T-celler uventet. Hverken NNMT eller AOX1 kunne detekteres ved scRNA-seq-analyse og målrettet qPCR af to uafhængige kohorter. Disse resultater indikerer, at MNA ikke syntetiseres af T-celler, men absorberes fra det omgivende TME. In vitro-eksperimenter viser, at T-celler har tendens til at akkumulere eksogent MNA.
Vores in vitro-studier har vist, at eksogen MNA inducerer ekspressionen af ​​TNFα i T-celler og forstærker bindingen af ​​Sp1 til TNFα-promotoren. Selvom TNFα har både antitumor- og antitumorfunktioner, kan TNFα fremme væksten af ​​ovariecancer i ovariecancer (31-33). Neutraliseringen af ​​TNFα i ovarietumorcellekultur eller elimineringen af ​​TNFα-signalet i musemodeller kan forbedre TNFα-medieret inflammatorisk cytokinproduktion og hæmme tumorvækst (32, 35). Derfor kan TME-afledt MNA i dette tilfælde fungere som en proinflammatorisk metabolit gennem en TNFα-afhængig mekanisme gennem det autokrine loop og derved fremme forekomsten og spredningen af ​​ovariecancer (31). Baseret på denne mulighed undersøges TNFα-blokade som et potentielt terapeutisk middel mod ovariecancer (37, 48, 49). Derudover forringer MNA cytotoksiciteten af ​​CAR-T-celler over for ovarietumorceller, hvilket giver yderligere bevis for MNA-medieret immunsuppression. Samlet set tyder disse resultater på en model, hvor tumorer og CAF-celler udskiller MNA i ekstracellulær TME. Gennem (i) TNF-induceret stimulering af ovariecancervækst og (ii) hæmning af MNA-induceret T-celle cytotoksisk aktivitet kan dette have en dobbelt tumoreffekt (figur 5D).
Afslutningsvis afslørede denne undersøgelse ved at anvende en kombination af hurtig celleberigelse, enkeltcellesekventering og metabolisk profilering de enorme immunmetabolomiske forskelle mellem tumorer og ascitesceller hos patienter med højcellet sclerosis (HGSC). Denne omfattende analyse viste, at der er forskelle i glukoseoptagelse og mitokondrieaktivitet mellem T-celler, og identificerede MNA som en ikke-cellebaseret autonom immunregulerende metabolit. Disse data har indflydelse på, hvordan TME påvirker T-cellemetabolismen i humane kræftformer. Selvom der er rapporteret om direkte konkurrence om næringsstoffer mellem T-celler og kræftceller, kan metabolitter også fungere som indirekte regulatorer for at fremme tumorprogression og muligvis undertrykke endogene immunresponser. En yderligere beskrivelse af den funktionelle rolle af disse regulatoriske metabolitter kan åbne op for alternative strategier til at forbedre antitumorimmunresponset.
Patientprøver og kliniske data blev indhentet gennem BC's kræfttumorvævsarkiv, der er certificeret af Canadian Tissue Repository Network. I henhold til protokollen godkendt af BC Cancer Research Ethics Committee og University of British Columbia (H07-00463) blev alle patienters prøver og kliniske data indhentet informeret skriftligt samtykke eller formelt givet afkald på deres samtykke. Prøverne opbevares i den certificerede BioBank (BRC-00290). Detaljerede patientkarakteristika er vist i tabel S1 og S5. Til kryopræservering bruges en skalpel til mekanisk at nedbryde patientens tumorprøve og derefter skubbe den gennem et 100-mikron filter for at opnå en enkeltcellesuspension. Patientens ascites blev centrifugeret ved 1500 rpm i 10 minutter ved 4°C for at pelletere cellerne og fjerne supernatanten. Celler fra tumor og ascites blev kryopræserveret i 50% varmeinaktiveret humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) og 10% dimethylsulfoxid. Disse konserverede enkeltcellesuspensioner blev optøet og anvendt til metabolomik og metabolitbestemmelse som beskrevet nedenfor.
Det komplette medium består af 0,22 μm filtreret 50:50 suppleret med RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) suppleret med 10% varmeinaktiveret humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) opløsning (Thermo Fisher Scientific) og 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) er suppleret med 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) og 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Flowcytometerets farvningsbuffer bestod af 0,22 μm filtreret fosfatbufret saltvand (PBS; Invitrogen) suppleret med 3% varmeinaktiveret AB humant serum (Sigma). Celleberigelsesbufferen består af 0,22 μm filtreret PBS og suppleret med 0,5% varmeinaktiveret humant AB-serum (Sigma-Aldrich).
I 37°C komplet medium blev cellerne farvet med 10 nM MT DR og 100 μM 2-NBDG i 30 minutter. Derefter blev cellerne farvet med levedygtighedsfarvestoffet eF506 ved 4°C i 15 minutter. Resuspender cellerne i FC Block (eBioscience) og Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), fortynd i flowcytometri-farvningsbuffer (i henhold til producentens instruktioner), og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Farv cellerne med et sæt antistoffer (tabel S2) i flowcytometri-farvningsbuffer ved 4°C i 20 minutter. Resuspender cellerne i flowcytometri-farvningsbuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguration) før analyse. Brug SpectroFlo og FlowJo V10 til at analysere celletællingsdata, og brug GraphPad Prism 8 til at oprette dataene. Medianfluorescensintensiteten (MFI) for 2-NBDG og MT DR blev log-normaliseret, og derefter blev en parret t-test anvendt til statistisk analyse for at tage højde for matchede patienter. Fjern alle populationer med færre end 40 hændelser fra analysen; indtast en MFI-værdi på 1 for eventuelle negative værdier, før statistisk analyse og datavisualisering udføres.
For at supplere den manuelle gatingstrategi i ovenstående procespanel brugte vi den fulde annotering fra shape restriction tree (FAUST) (21) til automatisk at tildele celler til populationen efter eliminering af døde celler i FlowJo. Vi administrerer manuelt outputtet for at flette populationer, der synes at være forkert allokeret (kombination af PD1+ med PD1-tumorceller) og tilbageholdte populationer. Hver prøve indeholder i gennemsnit mere end 2% celler, i alt 11 populationer.
Ficoll gradientdensitetscentrifugering blev anvendt til at separere PBMC fra leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies). CD8+ T-celler blev isoleret fra PBMC ved hjælp af CD8 MicroBeads (Miltenyi) og ekspanderet i komplet medium ved hjælp af TransAct (Miltenyi) i 2 uger i henhold til producentens instruktioner. Cellerne fik lov til at stå i 5 dage i komplet medium indeholdende IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) og derefter restimuleret med TransAct. På dag 7 blev humane CD45 MicroBeads (Miltenyi) i henhold til producentens instruktioner anvendt til at berige celler i tre på hinanden følgende runder. Cellerne blev alikvoteret til flowcytometrianalyse (som beskrevet ovenfor), og en million celler blev alikvoteret tre gange til LC-MS/MS-analyse. Prøverne blev behandlet ved LC-MS/MS som beskrevet nedenfor. Vi estimerede den manglende metabolitværdi med et iontal på 1.000. Hver prøve normaliseres med det samlede iontal (TIC), konverteres logaritmisk og normaliseres automatisk i MetaboAnalystR før analyse.
Enkeltcellesuspensionen fra hver patient blev optøet og filtreret gennem et 40 μm filter til komplet medium (som beskrevet ovenfor). I henhold til producentens protokol blev tre på hinanden følgende runder med positiv selektion ved magnetisk perleseparation ved hjælp af MicroBeads (Miltenyi) anvendt til at berige prøverne for CD8+, CD4+ og CD45- celler (på is). Kort sagt resuspenderes cellerne i celleberigelsesbuffer (som beskrevet ovenfor) og tælles. Cellerne blev inkuberet med humane CD8-perler, humane CD4-perler eller humane CD45-perler (Miltenyi) ved 4°C i 15 minutter og derefter vasket med celleberigelsesbuffer. Prøven føres gennem LS-kolonnen (Miltenyi), og de positive og negative fraktioner opsamles. For at reducere varigheden og maksimere cellegendannelsestrinnet anvendes CD8-fraktionen derefter til den anden runde af CD4+-berigelse, og CD4-fraktionen anvendes til den efterfølgende CD45-berigelse. Opløsningen holdes på is under hele separationsprocessen.
For at forberede prøver til metabolitanalyse blev cellerne vasket én gang med iskold saltopløsning, og 1 ml 80% methanol blev tilsat til hver prøve, derefter vortexet og lynfrosset i flydende nitrogen. Prøverne blev underkastet tre fryse-optøningscyklusser og centrifugeret ved 14.000 rpm i 15 minutter ved 4°C. Supernatanten indeholdende metabolitterne inddampes, indtil den er tør. Metabolitterne blev genopløst i 50 μl 0,03% myresyre, vortexet for at blande og derefter centrifugeret for at fjerne rester.
Ekstraher metabolitter som beskrevet ovenfor. Overfør supernatanten til en højtydende væskekromatografiflaske til metabolomisk forskning. Brug en tilfældig behandlingsprotokol til at behandle hver prøve med et lignende antal celler for at forhindre batcheffekter. Vi udførte en kvalitativ vurdering af globale metabolitter, der tidligere er offentliggjort på AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografisk analyse og integration af peak area blev udført ved hjælp af MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Et ionantal på 1000 blev brugt til at estimere den manglende metabolitværdi, og TIC'en for hver prøve blev brugt til at beregne det normaliserede topareal for hver detekteret metabolit for at korrigere for ændringer introduceret af den instrumentelle analyse fra prøvebehandlingen. Efter TIC er normaliseret, bruges MetaboAnalystR(51) (standardparameter) til logaritmisk konvertering og automatisk normlinjeskalering. Vi brugte PCA med vegan R-pakken til at udføre en eksplorativ analyse af metabolomforskelle mellem prøvetyper og brugte delvis redundansanalyse til at analysere patienter. Vi brugte Ward-metoden til at konstruere et varmekort-dendrogram til at gruppere den euklidiske afstand mellem prøver. Vi brugte limma (52) på standardiseret metabolitforekomst til at identificere differentielt rigelige metabolitter på tværs af hele celletypen og mikromiljøet. For at forenkle forklaringen bruger vi gruppemiddelparameteren til at specificere modellen og betragter celletyperne i mikromiljøet som hver gruppe (n = 6 grupper); Til signifikanstesten udførte vi tre gentagne målinger for hver metabolit. For at undgå falsk replikation blev patienten inkluderet som en hindring i limmadesignet. For at kontrollere forskellene i metabolitter mellem forskellige patienter justerede vi limmamodellen, så den inkluderede patienter på en fast måde. Vi rapporterer signifikansen af ​​den præspecificerede kontrast mellem celletypen og mikromiljøet for Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-korrektion).
Efter vigorberigelse ved hjælp af Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80 % levedygtighed) blev enkeltcelletranskriptomsekventering udført på de samlede levende frosne ascites- og tumorprøver ved hjælp af en 10x 5'-genekspressionsprotokol. Fem tilfælde med matchende tumorer og ascites blev analyseret, selvom den lave levedygtighed fra én tumorprøve forhindrede dens inkludering. For at opnå flere patientselektioner kombinerede vi prøverne fra hver patient i banerne i 10x kromcontrolleren og analyserede ascites- og tumorstederne separat. Efter sekventering [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp parret ende (PE), Quebec-genom; et gennemsnit på 73.488 og 41.378 aflæsninger pr. celle for henholdsvis tumor og ascites]], brugte vi CellSNP og Vireo (53) (baseret på CellSNP som Den almindelige humane SNP (VCF) leveret af GRCh38 tildeles en donoridentitet. Vi bruger SNPRelate til at udlede den nærmeste identitet (IBS) af patientens genotypestatus (IBS), eksklusive ikke-tildelte celler og celler identificeret som duplexer og matchende donorer mellem ascites- og tumorprøver (54). På baggrund af denne opgave beholdt vi tre tilfælde med rigelig cellerepræsentation i tumor og ascites til downstream-analyse. Efter at have udført et massefiltreringstrin i scater (55) og scran (56) BioConductor-pakningen gav dette 6975 celler (2792 og 4183 celler fra henholdsvis tumor og ascites) til analyse. Vi bruger igraphs (57) Louvain-klyngedannelse af delt nærmeste nabo-netværk (SNN) baseret på Jaccard-afstand til klyngeceller efter ekspression. Klynger blev manuelt annoteret til formodede celletyper baseret på markørgenekspression og visualiseret med t-SNE. Cytotoksiske T-celler er defineret ved ekspressionen af ​​CD8A og GZMA, eksklusive subklynger med lav ribosomal proteinekspression. Vi tilgik de publicerede data fra Izar et al. (16), inklusive deres t-SNE-indlejring, som kan kontrollere ekspressionsoverlapningen mellem immuncellemarkører og NNMT-ekspression.
PBMC blev separeret fra leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies) ved Ficoll gradientdensitetscentrifugering. CD3+ celler blev isoleret fra PBMC ved hjælp af CD3-perler (Miltenyi). Med eller uden MNA blev CD3+ celler aktiveret med pladebundet CD3 (5μg/ml), opløseligt CD28 (3μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin). På den sidste dag af ekspansionen blev levedygtigheden (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) og proliferationen (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) evalueret ved flowcytometri. Evaluer effektorfunktionen ved at stimulere celler med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1μg/ml) med GolgiStop i 4 timer, og monitorer CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) og TNFα-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (MAb11, BD). Stimuler qPCR- og ChIP-celler med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1μg/ml) i 4 timer. ELISA-supernatanten blev opsamlet før og efter stimulering med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1 μg/ml) i 4 timer.
Følg producentens protokol for at isolere RNA ved hjælp af RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Brug QIAshredder (QIAGEN) til at homogenisere prøven. Brug et high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) til at syntetisere komplementært DNA (cDNA). Brug TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) til at kvantificere genekspression (i henhold til producentens protokol) med følgende prober: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyd-3-phosphat off Hydrogen (GAPDH)] og Hs01010726_m1 (SLC22A2). Prøverne blev kørt på StepOnePlus real-time PCR-systemet (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) i MicroAmp fast optical 96-brønds reaktionsplade (Applied Biosystems) med MicroAmp optisk film. Enhver Ct-værdi, der overstiger 35, betragtes som værende over detektionstærsklen og markeres som ikke-detekterbar.
Udfør ChIP som tidligere beskrevet (58). Kort sagt blev cellerne behandlet med formaldehyd (slutkoncentration 1,42%) og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. Brug suppleret kvældningsbuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl og 0,1% NP-40) på is i 10 minutter, og resuspender derefter i immunpræcipitationsbuffer som beskrevet (58). Prøven blev derefter sonikeret med følgende cyklusser: 10 cyklusser (20 1-sekunds pulser) og en statisk tid på 40 sekunder. Inkuber ChIP-kvalitet immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) og SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antistoffer med prøven ved 4°CC og ryst natten over. Inkuber protein A-perler (Thermo Fisher Scientific) med prøven ved 4 °C under forsigtig omrystning i 1 time, brug derefter chelex-perler (Bio-Rad) til at berige DNA'et, og brug proteinase K (Thermo Fisher) til proteinfordøjelse. TNFα-promotoren blev detekteret ved PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; derimod, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkt). Billederne blev produceret af Image Lab (Bio-Rad) og kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software.
Cellekultursupernatanten blev opsamlet som beskrevet ovenfor. Bestemmelsen blev udført i henhold til producentens procedurer for humant TNFα ELISA-kit (Invitrogen), humant IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) og humant IFN-γ ELISA-kit (Abcam). I henhold til producentens protokol blev supernatanten fortyndet 1:100 for at detektere TNFα og IL-2 og 1:3 for at detektere IFN-γ. Brug EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) til at måle absorbansen ved 450 nm.
PBMC blev separeret fra leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies) ved hjælp af Ficoll gradientdensitetscentrifugering. CD3+ celler blev isoleret fra PBMC ved hjælp af CD3-perler (Miltenyi). Med eller uden MNA blev CD3+ celler aktiveret med pladebundet CD3 (5μg/ml), opløseligt CD28 (3μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin) i 3 dage. Efter 3 dage blev cellerne opsamlet og vasket med 0,9% saltvand, og pelleten blev lynfrosset. Celletælling blev udført ved flowcytometri (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguration) ved hjælp af 123count eBeads.
Ekstraktmetabolitter som beskrevet ovenfor. Det tørrede ekstrakt blev rekonstitueret ved en koncentration på 4000 celleækvivalenter/μl. Analysér prøven ved omvendt fasekromatografi (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og CORTECS T3-søjle (2,1 × 150 mm, partikelstørrelse 1,6 μm, porestørrelse 120 Å; #186008500, Waters). Polært massespektrometer (6470, Agilent), hvor elektrosprayionisering fungerer i positiv tilstand. Mobil fase A er 0,1 % myresyre (i H2O), mobil fase B er 90 % acetonitril, 0,1 % myresyre. LC-gradienten er 0 til 2 minutter for 100% A, 2 til 7,1 minutter for 99% B og 7,1 til 8 minutter for 99% B. Reækvilibrer derefter kolonnen med mobil fase A ved en flowhastighed på 0,6 ml/min i 3 minutter. Flowhastigheden er 0,4 ml/min, og kolonnekammeret opvarmes til 50°C. Brug MNA's rene kemiske standard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) til at fastslå retentionstid (RT) og transformation (RT = 0,882 minutter, transformation 1 = 137→94,1, transformation 2 = 137→92, Konvertering 3 = 137→78). Når alle tre overgange forekommer ved den korrekte retentionstid, anvendes overgang 1 til kvantificering for at sikre specificitet. Standardkurven for MNA (Toronto Research Chemical Company) blev genereret ved seks serielle fortyndinger af stamopløsningen (1 mg/ml) for at opnå standarder på henholdsvis 0,1, 1,0, 10 og 100 ng/ml og 1,0 og 10 μg/ml væske. Detektionsgrænsen er 1 ng/ml, og det lineære respons er mellem 10 ng/ml og 10 μg/ml. Hver injektion af to mikroliter prøve og standard anvendes til LC/MS-analyse, og en blandet kvalitetskontrolprøve udføres for hver ottende injektion for at sikre analyseplatformens stabilitet. MNA-responserne for alle MNA-behandlede celleprøver lå inden for analysens lineære område. Dataanalysen blev udført ved hjælp af MassHunter kvantitativ analysesoftware (v9.0, Agilent).
Anden generations αFR-CAR-konstruktionen blev taget fra Song et al. (59). Kort sagt indeholder konstruktionen følgende indhold: CD8a-ledersekvens, humant αFR-specifikt enkeltkædet variabelt fragment, CD8a-hængsels- og transmembranregion, CD27 intracellulært domæne og CD3z intracellulært domæne. Den komplette CAR-sekvens blev syntetiseret af GenScript og derefter klonet ind i anden generations lentivirale ekspressionsvektor opstrøms for GFP-ekspressionskassetten, der blev brugt til at evaluere transduktionseffektiviteten.
Lentivirus produceres ved transfektion af HEK293T-celler [American Type Culture Collection (ATCC]; dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium indeholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % PenStrep, og anvendt CAR-GFP-vektor, og pakningsplasmiderne (psPAX2 og pMD2.G, Addgene) anvender lipofektionsamin (Sigma-Aldrich). Den virusholdige supernatant blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion, filtreret og koncentreret ved ultracentrifugering. Opbevar den koncentrerede virale supernatant ved -80 °C indtil transduktion.
PBMC separeres fra raske donor leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies) ved Ficoll gradientdensitetscentrifugering. Brug positiv selektion af CD8-mikroperler (Miltenyi) til at isolere CD8+ celler fra PBMC. Stimuler T-celler med TransAct (Miltenyi) og i TexMACS-medium [Miltenyi; suppleret med 3% varmeinaktiveret humant serum, 1% PenStrep og IL-2 (300 U/ml)]. Fireogtyve timer efter stimulering blev T-celler transduceret med lentivirus (10 μl koncentreret virussupernatant pr. 106 celler). 1 til 3 dage efter transduktion på Cytek Aurora (på FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) evalueres cellernes GFP-ekspression for at demonstrere en transduktionseffektivitet på mindst 30%.
CAR-T-celler blev dyrket i 24 timer i Immunocult (STEMCELL Technologies; suppleret med 1% PenStrep) under følgende betingelser: ubehandlet, behandlet med 250 μM adenosin eller 10 mM MNA. Efter forbehandling blev CAR-T-cellerne vasket med PBS og kombineret med 20.000 SK-OV-3-celler [ATCC; i McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) suppleret med 10% FBS og 1% PenStrep ved 10: Effektor-til-mål-forholdet på 1 blev amplificeret i triplikat i suppleret Immunocult-medium. SK-OV-3-celler og SK-OV-3-celler lyseret med digitalis-saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) blev anvendt som henholdsvis negative og positive kontroller. Efter 24 timers samdyrkning blev supernatanten opsamlet, og laktatdehydrogenasen (LDH) blev målt i henhold til producentens instruktioner (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH-supernatanten blev fortyndet 1:50 i LDH-buffer. Drabsprocenten blev målt ved hjælp af følgende formel: drabsprocent = korrektionsprocent / maksimal drabsrate x 100 %, hvor korrektionsprocent = co-kultur - kun T-celler, og maksimal drabsrate = positiv kontrol - negativ kontrol.
Som beskrevet i teksten eller materialerne og metoderne, brug GraphPad Prism 8, Microsoft Excel eller R v3.6.0 til statistisk analyse. Hvis der indsamles flere prøver fra den samme patient (såsom ascites og tumor), bruger vi en parret t-test eller inkluderer patienten som en tilfældig effekt i en lineær eller generaliseret model, alt efter hvad der er relevant. Til metabolomisk analyse udføres vigtighedstesten i triplikat.
For supplerende materiale til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillader brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, så længe den endelige anvendelse ikke er til kommerciel gevinst, og forudsætningen er, at det originale værk er korrekt. Reference.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at den ikke er spam. Vi indsamler ikke nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende, og til at forhindre automatisk spamindsendelse.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), Russell G. Jones (Ralph G. Jones), Russell G. Jones (DeBussell). Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrager til immunsuppression af T-celler og repræsenterer et potentielt immunterapimål til behandling af kræft hos mennesker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), Russell G. Jones (Ralph G. Jones), Russell G. Jones (DeBussell). Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrager til immunsuppression af T-celler og repræsenterer et potentielt immunterapimål til behandling af kræft hos mennesker.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheder forbeholdes. AAAS er partner med HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.