Propionsyre (PPA), et svampedræbende middel og almindeligt kosttilskud, har vist sig at forårsage unormal neurologisk udvikling hos mus ledsaget af gastrointestinal dysfunktion, hvilket kan være forårsaget af tarmdysbiose. En sammenhæng mellem PPA-eksponering via kosten og dysbiose i tarmmikrobiotaen er blevet foreslået, men er ikke blevet direkte undersøgt. Her undersøgte vi PPA-associerede ændringer i tarmmikrobiotaens sammensætning, der kan føre til dysbiose. Tarmmikrobiomer hos mus fodret med en ubehandlet diæt (n=9) og en PPA-beriget diæt (n=13) blev sekventeret ved hjælp af langtrækkende metagenomisk sekventering for at vurdere forskelle i mikrobiel sammensætning og bakterielle metaboliske veje. PPA via kosten var forbundet med en stigning i forekomsten af signifikante taxa, herunder adskillige Bacteroides-, Prevotella- og Ruminococcus-arter, hvoraf medlemmer tidligere har været impliceret i PPA-produktion. Mikrobiomerne hos PPA-eksponerede mus havde også flere veje relateret til lipidmetabolisme og steroidhormonbiosyntese. Vores resultater indikerer, at PPA kan ændre tarmmikrobiotaen og dens tilhørende metaboliske veje. Disse observerede ændringer fremhæver, at konserveringsmidler, der er klassificeret som sikre til forbrug, kan påvirke sammensætningen af tarmmikrobiotaen og dermed menneskers sundhed. Blandt disse vælges P, G eller S afhængigt af det klassifikationsniveau, der analyseres. For at minimere virkningen af falsk positive klassifikationer blev der anvendt en minimumsgrænse for relativ forekomst på 1e-4 (1/10.000 aflæsninger). Før statistisk analyse blev de relative forekomster rapporteret af Bracken (fraction_total_reads) transformeret ved hjælp af centreret log-ratio (CLR) transformation (Aitchison, 1982). CLR-metoden blev valgt til datatransformation, fordi den er skalainvariant og tilstrækkelig til ikke-sparsomme datasæt (Gloor et al., 2017). CLR-transformationen bruger den naturlige logaritme. De optællingsdata, der rapporteres af Bracken, blev normaliseret ved hjælp af det relative logaritmeudtryk (RLE) (Anders og Huber, 2010). Tal blev genereret ved hjælp af en kombination af matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 og sekventielle logaritmer (Gloor et al., 2017). 0,12,2 og stantanotations v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes-forholdet blev beregnet for hver prøve ved hjælp af normaliserede bakterietællinger. Værdier rapporteret i tabellerne er afrundet til 4 decimaler. Simpson-diversitetsindekset blev beregnet ved hjælp af alpha_diversity.py-scriptet, der findes i KrakenTools v. 1.2-pakken (Lu et al., 2022). Bracken-rapporten findes i scriptet, og Simpson-indekset "Si" er angivet for -an-parameteren. Signifikante forskelle i forekomst blev defineret som gennemsnitlige CLR-forskelle ≥ 1 eller ≤ -1. En gennemsnitlig CLR-forskel på ±1 indikerer en 2,7-fold stigning i forekomsten af en prøvetype. Tegnet (+/-) angiver, om taxonet er mere rigeligt forekommende i henholdsvis PPA-prøven og kontrolprøven. Signifikansen blev bestemt ved hjælp af Mann-Whitney U-testen (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini og Hochberg, 1995; Seabold og Perktold, 2010) blev anvendt, og Benjamini-Hochberg-proceduren blev anvendt til at korrigere for multiple tests. En justeret p-værdi ≤ 0,05 blev brugt som tærskelværdi for bestemmelse af statistisk signifikans.
Det menneskelige mikrobiom omtales ofte som "kroppens sidste organ" og spiller en afgørende rolle i menneskers sundhed (Baquero og Nombela, 2012). Især tarmmikrobiomet er anerkendt for dets systemomfattende indflydelse og rolle i mange essentielle funktioner. Kommensale bakterier er rigelige i tarmen, optager flere økologiske nicher, udnytter næringsstoffer og konkurrerer med potentielle patogener (Jandhyala et al., 2015). Forskellige bakteriekomponenter i tarmmikrobiotaen er i stand til at producere essentielle næringsstoffer såsom vitaminer og fremme fordøjelsen (Rowland et al., 2018). Bakteriemetabolitter har også vist sig at påvirke vævsudviklingen og forbedre metaboliske og immunologiske veje (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Sammensætningen af det menneskelige tarmmikrobiom er ekstremt forskelligartet og afhænger af genetiske og miljømæssige faktorer såsom kost, køn, medicin og sundhedstilstand (Kumbhare et al., 2019).
Moderens kost er en kritisk komponent i fosterets og den nyfødtes udvikling og en formodet kilde til forbindelser, der kan påvirke udviklingen (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). En sådan forbindelse af interesse er propionsyre (PPA), et biprodukt af kortkædede fedtsyrer opnået fra bakteriel fermentering og et fødevaretilsætningsstof (den Besten et al., 2013). PPA har antibakterielle og svampedræbende egenskaber og bruges derfor som konserveringsmiddel til fødevarer og i industrielle anvendelser til at hæmme skimmel- og bakterievækst (Wemmenhove et al., 2016). PPA har forskellige virkninger i forskellige væv. I leveren har PPA antiinflammatoriske virkninger ved at påvirke cytokinekspression i makrofager (Kawasoe et al., 2022). Denne regulerende effekt er også blevet observeret i andre immunceller, hvilket fører til nedregulering af inflammation (Haase et al., 2021). Den modsatte effekt er dog blevet observeret i hjernen. Tidligere undersøgelser har vist, at PPA-eksponering inducerer autismelignende adfærd hos mus (El-Ansary et al., 2012). Andre undersøgelser har vist, at PPA kan inducere gliose og aktivere proinflammatoriske veje i hjernen (Abdelli et al., 2019). Da PPA er en svag syre, kan den diffundere gennem tarmepitelet ind i blodbanen og dermed krydse restriktive barrierer, herunder blod-hjerne-barrieren samt placenta (Stinson et al., 2019), hvilket fremhæver vigtigheden af PPA som en regulatorisk metabolit produceret af bakterier. Selvom PPA's potentielle rolle som en risikofaktor for autisme i øjeblikket er under undersøgelse, kan dens virkninger på personer med autisme række ud over at inducere neural differentiering.
Gastrointestinale symptomer såsom diarré og forstoppelse er almindelige hos patienter med neurologiske udviklingsforstyrrelser (Cao et al., 2021). Tidligere undersøgelser har vist, at mikrobiomet hos patienter med autismespektrumforstyrrelser (ASF) adskiller sig fra raske individers, hvilket tyder på tilstedeværelsen af tarmmikrobiotas dysbiose (Finegold et al., 2010). Tilsvarende adskiller mikrobiomets karakteristika hos patienter med inflammatoriske tarmsygdomme, fedme, Alzheimers sygdom osv. sig også fra raske individers (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Der er dog indtil videre ikke fastslået nogen årsagssammenhæng mellem tarmmikrobiomet og neurologiske sygdomme eller symptomer (Yap et al., 2021), selvom flere bakteriearter menes at spille en rolle i nogle af disse sygdomstilstande. For eksempel er Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio og andre slægter mere rigelige i mikrobiotaen hos patienter med autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Det er værd at bemærke, at medlemsarter af nogle af disse slægter er kendt for at besidde gener forbundet med PPA-produktion (Reichardt et al., 2014; Yun og Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur og Dürre, 2023). I betragtning af PPA's antimikrobielle egenskaber kan en øgning af dens forekomst være gavnlig for væksten af PPA-producerende bakterier (Jacobson et al., 2018). Et PFA-rigt miljø kan således føre til ændringer i tarmmikrobiotaen, herunder gastrointestinale patogener, hvilket kan være potentielle faktorer, der fører til gastrointestinale symptomer.
Et centralt spørgsmål i mikrobiomforskning er, om forskelle i mikrobiel sammensætning er en årsag til eller et symptom på underliggende sygdomme. Det første skridt i retning af at belyse det komplekse forhold mellem kost, tarmmikrobiomet og neurologiske sygdomme er at vurdere kostens virkninger på den mikrobielle sammensætning. Til dette formål anvendte vi long-read metagenomisk sekventering til at sammenligne tarmmikrobiomerne hos afkom af mus fodret med en PPA-rig eller PPA-udtømt kost. Afkommet fik den samme kost som deres mødre. Vi fremsatte den hypotese, at en PPA-rig kost ville resultere i ændringer i tarmens mikrobielle sammensætning og mikrobielle funktionelle veje, især dem, der er relateret til PPA-metabolisme og/eller PPA-produktion.
Dette studie anvendte FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgene mus (Jackson Laboratories), der overudtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af den glia-specifikke GFAP-promotor i henhold til retningslinjerne fra University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Efter fravænning blev musene anbragt individuelt i bure med 1-5 mus af hvert køn pr. bur. Musene blev fodret ad libitum med enten en oprenset kontroldiæt (modificeret åben standarddiæt, 16 kcal% fedt) eller en natriumpropionat-suppleret diæt (modificeret åben standarddiæt, 16 kcal% fedt, indeholdende 5.000 ppm natriumpropionat). Mængden af natriumpropionat, der blev anvendt, svarede til 5.000 mg PFA/kg samlet fodervægt. Dette er den højeste koncentration af PPA, der er godkendt til brug som konserveringsmiddel til fødevarer. For at forberede sig til dette studie blev forældremus fodret med begge diæter i 4 uger før parring og fortsatte gennem hele modermusenes drægtighed. Afkommus [22 mus, 9 kontrolmus (6 hanner, 3 hunner) og 13 PPA (4 hanner, 9 hunner)] blev vænnet fra og fortsatte derefter på samme diæt som modermusene i 5 måneder. Afkommusene blev aflivet i en alder af 5 måneder, og deres tarmfæcesindhold blev opsamlet og initialt opbevaret i 1,5 ml mikrocentrifugerør ved -20 °C og derefter overført til en -80 °C fryser, indtil værts-DNA var udtømt, og mikrobielle nukleinsyrer var ekstraheret.
Værts-DNA blev fjernet i henhold til en modificeret protokol (Charalampous et al., 2019). Kort fortalt blev fækalt indhold overført til 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) og opbevaret frossen. Der anvendes maksimalt 1-2 fækale pellets pr. ekstraktion. Fækal indholdet blev derefter mekanisk homogeniseret ved hjælp af en plastikstøder inde i røret for at danne en opslæmning. Centrifuger prøverne ved 10.000 RCF i 5 minutter, eller indtil prøverne er pelleteret, hvorefter supernatanten aspireres, og pelleten resuspenderes i 250 µl 1× PBS. Tilsæt 250 µl 4,4% saponinopløsning (TCI, produktnummer S0019) til prøven som et detergent til at løsne eukaryote cellemembraner. Prøverne blev forsigtigt blandet, indtil de var glatte, og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. For at nedbryde eukaryote celler blev der derefter tilsat 350 μl nukleasefrit vand til prøven, inkuberet i 30 sekunder, og derefter blev der tilsat 12 μl 5 M NaCl. Prøverne blev derefter centrifugeret ved 6000 RCF i 5 minutter. Supernatanten blev aspireret, og pelleten blev resuspenderet i 100 μl 1X PBS. For at fjerne værts-DNA tilsættes 100 μl HL-SAN-buffer (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleasefrit vand) og 10 μl HL-SAN-enzym (ArticZymes P/N 70910-202). Prøverne blev grundigt blandet ved pipettering og inkuberet ved 37 °C i 30 minutter ved 800 rpm på en Eppendorf™ ThermoMixer C. Efter inkubation blev de centrifugeret ved 6000 RCF i 3 minutter og vasket to gange med 800 µl og 1000 µl 1X PBS. Til sidst resuspenderes pelleten i 100 µl 1X PBS.
Totalt bakterielt DNA blev isoleret ved hjælp af New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, katalognr. T3010L). Standardproceduren, der følger med kittet, er en smule modificeret. Inkuber og hold nukleasefrit vand ved 60 °C før operation for endelig eluering. Tilsæt 10 µl Proteinase K og 3 µl RNase A til hver prøve. Tilsæt derefter 100 µl Cell Lysis Buffer, og bland forsigtigt. Prøverne blev derefter inkuberet i en Eppendorf™ ThermoMixer C ved 56 °C og 1400 rpm i mindst 1 time og op til 3 timer. Inkuberede prøver blev centrifugeret ved 12.000 RCF i 3 minutter, og supernatanten fra hver prøve blev overført til et separat 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 400 µl bindingsopløsning. Rørene blev derefter pulseret med vortex i 5-10 sekunder med intervaller på 1 sekund. Overfør hele væskeindholdet i hver prøve (ca. 600-700 µL) til en filterpatron placeret i et gennemstrømningsrør. Rørene blev centrifugeret ved 1.000 RCF i 3 minutter for at tillade initial DNA-binding og derefter centrifugeret ved 12.000 RCF i 1 minut for at fjerne resterende væske. Prøvesøjlen blev overført til et nyt opsamlingsrør og derefter vasket to gange. Til den første vask tilsættes 500 µL vaskebuffer til hvert rør. Vend røret på hovedet 3-5 gange, og centrifuger derefter ved 12.000 RCF i 1 minut. Kassér væsken fra opsamlingsrøret, og placer filterpatronen tilbage i det samme opsamlingsrør. Til den anden vask tilsættes 500 µL vaskebuffer til filteret uden at vende det på hovedet. Prøverne blev centrifugeret ved 12.000 RCF i 1 minut. Overfør filteret til et 1,5 ml LoBind®-rør, og tilsæt 100 µL forvarmet nukleasefrit vand. Filtrene blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 minut og derefter centrifugeret ved 12.000 RCF i 1 minut. Elueret DNA blev opbevaret ved -80 °C.
DNA-koncentrationen blev kvantificeret ved hjælp af et Qubit™ 4.0 Fluorometer. DNA blev fremstillet ved hjælp af Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (katalognr. Q33231) i henhold til producentens instruktioner. DNA-fragmentlængdefordelingen blev målt ved hjælp af en Aglient™ 4150 eller 4200 TapeStation. DNA blev fremstillet ved hjælp af Agilent™ Genomic DNA Reagents (katalognr. 5067-5366) og Genomic DNA ScreenTape (katalognr. 5067-5365). Biblioteksforberedelse blev udført ved hjælp af Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) i henhold til producentens instruktioner. DNA blev sekventeret ved hjælp af en ONT GridION™ Mk1-sequencer med en Min106D flowcelle (R 9.4.1). Sekventeringsindstillingerne var: basekaldning med høj nøjagtighed, minimum q-værdi på 9, stregkodeopsætning og stregkodetrimning. Prøverne blev sekventeret i 72 timer, hvorefter basisdata blev indsendt til videre behandling og analyse.
Bioinformatisk behandling blev udført ved hjælp af tidligere beskrevne metoder (Greenman et al., 2024). FASTQ-filerne fra sekventeringen blev opdelt i mapper for hver prøve. Før bioinformatisk analyse blev dataene behandlet ved hjælp af følgende pipeline: først blev FASTQ-filerne fra prøverne flettet sammen til en enkelt FASTQ-fil. Derefter blev aflæsninger kortere end 1000 bp filtreret ved hjælp af Filtlong v. 0.2.1, hvor den eneste ændrede parameter var –min_length 1000 (Wick, 2024). Før yderligere filtrering blev aflæsningskvaliteten kontrolleret ved hjælp af NanoPlot v. 1.41.3 med følgende parametre: –fastq –plots dot –N50 -o
Til taksonomisk klassificering blev reads og assemblerede contigs klassificeret ved hjælp af Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generer rapporter og outputfiler for henholdsvis reads og assembleres. Brug -use-names-indstillingen til at analysere reads og assembleres. -gzip-compressed og -paired-indstillingerne er angivet for read-segmenter. Den relative forekomst af taxa i metagenomer blev estimeret ved hjælp af Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Vi oprettede først en kmer-database indeholdende 1000 baser ved hjælp af bracken-build med følgende parametre: -d
Genannotering og relativ abundansestimering blev udført ved hjælp af en modificeret version af protokollen beskrevet af Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Først blev contigs kortere end 500 bp fjernet fra alle assemblies ved hjælp af SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). De udvalgte assemblies blev derefter kombineret til et pan-metagenom. Åbne læserammer (ORF'er) blev identificeret ved hjælp af Prodigal v. 1.0.1 (en parallel version af Prodigal v. 2.6.3) med følgende parametre: -d
Gener blev først grupperet i henhold til Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortolog (KO) identifikatorer tildelt af eggNOG for at sammenligne genpathway-forekomsten. Gener uden knockouts eller gener med flere knockouts blev fjernet før analyse. Den gennemsnitlige forekomst af hver KO pr. prøve blev derefter beregnet, og statistisk analyse blev udført. PPA-metabolismegener blev defineret som ethvert gen, der blev tildelt en række ko00640 i KEGG_Pathway-kolonnen, hvilket indikerer en rolle i propionatmetabolisme ifølge KEGG. Gener identificeret som associeret med PPA-produktion er anført i Supplerende Tabel 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutationstest blev udført for at identificere PPA-metabolisme- og produktionsgener, der var signifikant mere rigelige i hver prøvetype. Et tusind permutationer blev udført for hvert analyseret gen. En p-værdi på 0,05 blev brugt som en cutoff for at bestemme statistisk signifikans. Funktionelle annotationer blev tildelt individuelle gener inden for en klynge baseret på annotationerne af repræsentative gener inden for klyngen. Taxa forbundet med PPA-metabolisme og/eller PPA-produktion kunne identificeres ved at matche contig-ID'er i Kraken2-outputfilerne med de samme contig-ID'er, der blev bevaret under funktionel annotation ved hjælp af eggNOG. Signifikanstestning blev udført ved hjælp af den tidligere beskrevne Mann-Whitney U-test. Korrektion for multiple test blev udført ved hjælp af Benjamini-Hochberg-proceduren. En p-værdi på ≤ 0,05 blev brugt som en afskæringsværdi for at bestemme statistisk signifikans.
Diversiteten af musenes tarmmikrobiom blev vurderet ved hjælp af Simpsons diversitetsindeks. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem kontrol- og PPA-prøverne med hensyn til slægts- og artsdiversitet (p-værdi for slægt: 0,18, p-værdi for art: 0,16) (Figur 1). Den mikrobielle sammensætning blev derefter sammenlignet ved hjælp af principal component analysis (PCA). Figur 2 viser grupperingen af prøver efter deres rækker, hvilket indikerer, at der var forskelle i artssammensætningen af mikrobiomerne mellem PPA- og kontrolprøverne. Denne gruppering var mindre udtalt på slægtsniveau, hvilket tyder på, at PPA påvirker visse bakterier (Supplerende Fig. 1).
Figur 1. Alfa-diversitet af slægter og artssammensætning i musens tarmmikrobiom. Boksdiagrammer, der viser Simpson-diversitetsindekser for slægter (A) og arter (B) i PPA- og kontrolprøver. Signifikans blev bestemt ved hjælp af Mann-Whitney U-testen, og multipel korrektion blev udført ved hjælp af Benjamini-Hochberg-proceduren. ns, p-værdien var ikke signifikant (p>0,05).
Figur 2. Resultater af principal component-analyse af musens tarmmikrobiomsammensætning på artsniveau. Principal component-analyseplottet viser fordelingen af prøver på tværs af deres første to principal components. Farver angiver prøvetype: PPA-eksponerede mus er lilla, og kontrolmus er gule. Principal component 1 og 2 er plottet på henholdsvis x-aksen og y-aksen og udtrykkes som deres forklarede variansforhold.
Ved brug af RLE-transformerede tællingsdata blev der observeret et signifikant fald i medianforholdet mellem Bacteroidetes og Bacilli hos kontrol- og PPA-mus (kontrol: 9,66, PPA: 3,02; p-værdi = 0,0011). Denne forskel skyldtes en højere forekomst af Bacteroidetes hos PPA-mus sammenlignet med kontrolmus, selvom forskellen ikke var signifikant (gennemsnitlig CLR for kontrol: 5,51, gennemsnitlig CLR for PPA: 6,62; p-værdi = 0,054), mens forekomsten af Bacteroidetes var ens (gennemsnitlig CLR for kontrol: 7,76, gennemsnitlig CLR for PPA: 7,60; p-værdi = 0,18).
Analyse af forekomsten af taksonomiske medlemmer af tarmmikrobiomet viste, at 1 række og 77 arter adskilte sig signifikant mellem PPA- og kontrolprøverne (Supplerende Tabel 2). Forekomsten af 59 arter i PPA-prøverne var signifikant højere end i kontrolprøverne, mens forekomsten af kun 16 arter i kontrolprøverne var højere end i PPA-prøverne (Figur 3).
Figur 3. Differentiel forekomst af taxa i tarmmikrobiomet hos PPA- og kontrolmus. Vulkanplot viser forskelle i forekomsten af slægter (A) eller arter (B) mellem PPA- og kontrolprøver. Grå prikker indikerer ingen signifikant forskel i taxaforekomst. Farvede prikker indikerer signifikante forskelle i forekomst (p-værdi ≤ 0,05). De 20 største taxa med de største forskelle i forekomst mellem prøvetyper er vist med henholdsvis rød og lyseblå (kontrol- og PPA-prøver). Gule og lilla prikker var mindst 2,7 gange mere forekomst i kontrol- eller PPA-prøver end i kontroller. Sorte prikker repræsenterer taxa med signifikant forskellige forekomster, med gennemsnitlige CLR-forskelle mellem -1 og 1. P-værdier blev beregnet ved hjælp af Mann-Whitney U-testen og korrigeret for multiple tests ved hjælp af Benjamini-Hochberg-proceduren. Fed gennemsnitlige CLR-forskelle indikerer signifikante forskelle i forekomst.
Efter at have analyseret tarmmikrobielle sammensætninger, udførte vi en funktionel annotation af mikrobiomet. Efter at have filtreret gener af lav kvalitet fra, blev i alt 378.355 unikke gener identificeret på tværs af alle prøver. Den transformerede forekomst af disse gener blev brugt til principal component analysis (PCA), og resultaterne viste en høj grad af klyngedannelse af prøvetyper baseret på deres funktionelle profiler (Figur 4).
Figur 4. PCA-resultater ved hjælp af den funktionelle profil af musens tarmmikrobiom. PCA-plottet viser fordelingen af prøver på tværs af deres to første hovedkomponenter. Farver angiver prøvetype: PPA-eksponerede mus er lilla, og kontrolmus er gule. Hovedkomponenterne 1 og 2 er plottet på henholdsvis x-aksen og y-aksen og udtrykkes som deres forklarede variansforhold.
Vi undersøgte derefter forekomsten af KEGG-knockouts i forskellige prøvetyper. I alt 3648 unikke knockouts blev identificeret, hvoraf 196 var signifikant mere rigelige i kontrolprøver og 106 var mere rigelige i PPA-prøver (Figur 5). I alt 145 gener blev detekteret i kontrolprøver og 61 gener i PPA-prøver, med signifikant forskellige forekomster. Signalveje relateret til lipid- og aminosukkermetabolisme var signifikant mere beriget i PPA-prøver (Supplerende Tabel 3). Signalveje relateret til nitrogenmetabolisme og svovlrelæsystemer var signifikant mere beriget i kontrolprøver (Supplerende Tabel 3). Forekomsten af gener relateret til aminosukker/nukleotidmetabolisme (ko:K21279) og inositolfosfatmetabolisme (ko:K07291) var signifikant højere i PPA-prøver (Figur 5). Kontrolprøver havde signifikant flere gener relateret til benzoatmetabolisme (ko:K22270), nitrogenmetabolisme (ko:K00368) og glykolyse/glukoneogenese (ko:K00131) (Figur 5).
Fig. 5. Differentiel forekomst af KO'er i tarmmikrobiomet hos PPA- og kontrolmus. Vulkanplottet viser forskellene i forekomsten af funktionelle grupper (KO'er). Grå prikker angiver KO'er, hvis forekomst ikke var signifikant forskellig mellem prøvetyper (p-værdi > 0,05). Farvede prikker angiver signifikante forskelle i forekomst (p-værdi ≤ 0,05). De 20 KO'er med de største forskelle i forekomst mellem prøvetyper er vist i rød og lyseblå, svarende til henholdsvis kontrol- og PPA-prøver. Gule og lilla prikker angiver KO'er, der var mindst 2,7 gange mere forekomster i henholdsvis kontrol- og PPA-prøver. Sorte prikker angiver KO'er med signifikant forskellige forekomster, med gennemsnitlige CLR-forskelle mellem -1 og 1. P-værdier blev beregnet ved hjælp af Mann-Whitney U-testen og justeret for multiple sammenligninger ved hjælp af Benjamini-Hochberg-proceduren. NaN angiver, at KO'en ikke tilhører en signalvej i KEGG. Fed gennemsnitlige CLR-forskelværdier angiver signifikante forskelle i forekomst. For detaljerede oplysninger om de signalveje, som de anførte KO'er tilhører, se Supplerende Tabel 3.
Blandt de annoterede gener havde 1601 gener signifikant forskellige forekomster mellem prøvetyperne (p ≤ 0,05), hvor hvert gen var mindst 2,7 gange mere rigeligt. Af disse gener var 4 gener mere rigelige i kontrolprøver, og 1597 gener var mere rigelige i PPA-prøver. Da PPA har antimikrobielle egenskaber, undersøgte vi forekomsten af PPA-metabolisme- og produktionsgener mellem prøvetyperne. Blandt de 1332 PPA-metabolismerelaterede gener var 27 gener signifikant mere rigelige i kontrolprøver, og 12 gener var mere rigelige i PPA-prøver. Blandt de 223 PPA-produktionsrelaterede gener var 1 gen signifikant mere rigeligt i PPA-prøver. Figur 6A viser yderligere den højere forekomst af gener involveret i PPA-metabolisme, med signifikant højere forekomst i kontrolprøver og store effektstørrelser, mens figur 6B fremhæver individuelle gener med signifikant højere forekomst observeret i PPA-prøver.
Fig. 6. Differentiel forekomst af PPA-relaterede gener i musens tarmmikrobiom. Vulkanplot viser forskellene i forekomsten af gener forbundet med PPA-metabolisme (A) og PPA-produktion (B). Grå prikker angiver gener, hvis forekomst ikke var signifikant forskellig mellem prøvetyper (p-værdi > 0,05). Farvede prikker angiver signifikante forskelle i forekomst (p-værdi ≤ 0,05). De 20 gener med de største forskelle i forekomst er vist i henholdsvis rød og lyseblå (kontrol- og PPA-prøver). Forekomsten af gule og lilla prikker var mindst 2,7 gange større i kontrol- og PPA-prøver end i kontrolprøver. Sorte prikker repræsenterer gener med signifikant forskellige forekomster, med gennemsnitlige CLR-forskelle mellem -1 og 1. P-værdier blev beregnet ved hjælp af Mann-Whitney U-testen og korrigeret for multiple sammenligninger ved hjælp af Benjamini-Hochberg-proceduren. Gener svarer til repræsentative gener i det ikke-redundante genkatalog. Gennavne består af KEGG-symbolet, der angiver et KO-gen. Fed gennemsnitlige CLR-forskelle angiver signifikant forskellige forekomster. En bindestreg (-) angiver, at der ikke er noget symbol for genet i KEGG-databasen.
Taxa med gener relateret til PPA-metabolisme og/eller -produktion blev identificeret ved at matche contigs' taksonomiske identitet med genets contig-ID. På slægtsniveau blev der fundet 130 slægter med gener relateret til PPA-metabolisme, og 61 slægter med gener relateret til PPA-produktion (Supplerende Tabel 4). Imidlertid viste ingen slægter signifikante forskelle i forekomst (p > 0,05).
På artsniveau blev der fundet 144 bakteriearter med gener forbundet med PPA-metabolisme, og 68 bakteriearter med gener forbundet med PPA-produktion (Supplerende Tabel 5). Blandt PPA-metabolisatorerne viste otte bakterier signifikante stigninger i forekomst mellem prøvetyper, og alle viste signifikante ændringer i effekt (Supplerende Tabel 6). Alle identificerede PPA-metabolisatorer med signifikante forskelle i forekomst var mere rigelige i PPA-prøver. Klassificering på artsniveau afslørede repræsentanter for slægter, der ikke adskilte sig signifikant mellem prøvetyper, herunder adskillige Bacteroides- og Ruminococcus-arter, samt Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus og Alcaligenes polymorpha. Blandt de PPA-producerende bakterier viste fire bakterier signifikante forskelle i forekomst mellem prøvetyper. Arter med signifikante forskelle i forekomst omfattede Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis og Ruminococcus bovis.
I dette studie undersøgte vi virkningerne af PPA-eksponering på mus' tarmmikrobiota. PPA kan fremkalde forskellige reaktioner hos bakterier, fordi det produceres af bestemte arter, bruges som fødekilde af andre arter eller har antimikrobielle virkninger. Derfor kan dets tilsætning til tarmmiljøet via kosttilskud have forskellige virkninger afhængigt af tolerance, modtagelighed og evnen til at udnytte det som næringskilde. Følsomme bakteriearter kan elimineres og erstattes af dem, der er mere resistente over for PPA eller i stand til at udnytte det som fødekilde, hvilket fører til ændringer i tarmmikrobiotaens sammensætning. Vores resultater afslørede signifikante forskelle i mikrobiel sammensætning, men ingen effekt på den samlede mikrobielle diversitet. De største virkninger blev observeret på artsniveau, med over 70 taxa, der var signifikant forskellige i mængde mellem PPA og kontrolprøver (Supplerende Tabel 2). Yderligere evaluering af sammensætningen af PPA-eksponerede prøver afslørede større heterogenitet af mikrobielle arter sammenlignet med ueksponerede prøver, hvilket tyder på, at PPA kan forbedre bakterievækstegenskaber og begrænse bakteriepopulationer, der kan overleve i PPA-rige miljøer. Således kan PPA selektivt inducere ændringer snarere end at forårsage udbredt forstyrrelse af tarmmikrobiotaens diversitet.
Fødevarekonserveringsmidler som PPA har tidligere vist sig at ændre forekomsten af tarmmikrobiomkomponenter uden at påvirke den samlede diversitet (Nagpal et al., 2021). Her observerede vi de mest slående forskelle mellem Bacteroidetes-arter inden for rækken Bacteroidetes (tidligere kendt som Bacteroidetes), som var signifikant beriget i PPA-eksponerede mus. Øget forekomst af Bacteroides-arter er forbundet med øget slimnedbrydning, hvilket kan øge risikoen for infektion og fremme inflammation (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). En undersøgelse viste, at neonatale hanmus behandlet med Bacteroides fragilis udviste social adfærd, der minder om autismespektrumforstyrrelse (ASD) (Carmel et al., 2023), og andre undersøgelser har vist, at Bacteroides-arter kan ændre immunaktiviteten og føre til autoimmun inflammatorisk kardiomyopati (Gil-Cruz et al., 2019). Arter tilhørende slægterne Ruminococcus, Prevotella og Parabacteroides var også signifikant forøgede hos mus udsat for PPA (Coretti et al., 2018). Visse Ruminococcus-arter er forbundet med sygdomme som Crohns sygdom gennem produktion af proinflammatoriske cytokiner (Henke et al., 2019), mens Prevotella-arter som Prevotella humani er forbundet med metaboliske sygdomme som hypertension og insulinfølsomhed (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Endelig fandt vi, at forholdet mellem Bacteroidetes (tidligere kendt som Firmicutes) og Bacteroidetes var signifikant lavere hos PPA-eksponerede mus end hos kontrolmus på grund af en højere samlet forekomst af Bacteroidetes-arter. Dette forhold har tidligere vist sig at være en vigtig indikator for intestinal homeostase, og forstyrrelser i dette forhold har været forbundet med forskellige sygdomstilstande (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), herunder inflammatoriske tarmsygdomme (Stojanov et al., 2020). Samlet set synes arter af rækken Bacteroidetes at være stærkest påvirket af forhøjet PPA i kosten. Dette kan skyldes en højere tolerance over for PPA eller evnen til at udnytte PPA som energikilde, hvilket har vist sig at være tilfældet for mindst én art, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativt kan eksponering for PPA hos moderen forbedre fosterudviklingen ved at gøre tarmen hos museafkom mere modtagelig for Bacteroidetes-kolonisering; vores studiedesign tillod dog ikke en sådan vurdering.
En metagenomisk vurdering af indholdet afslørede signifikante forskelle i forekomsten af gener forbundet med PPA-metabolisme og -produktion, hvor PPA-eksponerede mus udviste en højere forekomst af gener ansvarlige for PPA-produktion, hvorimod ikke-PPA-eksponerede mus udviste en højere forekomst af gener ansvarlige for PAA-metabolisme (Figur 6). Disse resultater tyder på, at effekten af PPA på den mikrobielle sammensætning muligvis ikke udelukkende skyldes dets anvendelse, ellers burde forekomsten af gener forbundet med PPA-metabolisme have vist en højere forekomst i tarmmikrobiomet hos PPA-eksponerede mus. En forklaring er, at PPA medierer bakteriel forekomst primært gennem dets antimikrobielle virkninger snarere end gennem dets anvendelse af bakterier som næringsstof. Tidligere undersøgelser har vist, at PPA hæmmer væksten af Salmonella Typhimurium på en dosisafhængig måde (Jacobson et al., 2018). Eksponering for højere koncentrationer af PPA kan selektere for bakterier, der er resistente over for dets antimikrobielle egenskaber og ikke nødvendigvis er i stand til at metabolisere eller producere det. For eksempel viste adskillige Parabacteroides-arter signifikant højere forekomst i PPA-prøver, men der blev ikke påvist gener relateret til PPA-metabolisme eller -produktion (Supplerende tabel 2, 4 og 5). Desuden er PPA-produktion som et fermenteringsbiprodukt bredt fordelt blandt forskellige bakterier (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Højere bakteriediversitet kan være årsagen til den højere forekomst af gener relateret til PPA-metabolisme i kontrolprøver (Averina et al., 2020). Desuden blev kun 27 (2,14%) af 1332 gener forudsagt at være gener udelukkende forbundet med PPA-metabolisme. Mange gener forbundet med PPA-metabolisme er også involveret i andre metaboliske veje. Dette viser yderligere, at forekomsten af gener involveret i PPA-metabolisme var højere i kontrolprøverne; disse gener kan fungere i veje, der ikke resulterer i PPA-udnyttelse eller -dannelse som et biprodukt. I dette tilfælde viste kun ét gen forbundet med PPA-generering signifikante forskelle i forekomst mellem prøvetyper. I modsætning til gener forbundet med PPA-metabolisme blev markørgener for PPA-produktion udvalgt, fordi de er direkte involveret i den bakterielle vej for PPA-produktion. Hos PPA-eksponerede mus blev der fundet signifikant øget forekomst og kapacitet til at producere PPA hos alle arter. Dette understøtter forudsigelsen om, at PPA'er ville selektere PPA-producenter og derfor forudsige, at PPA-produktionskapaciteten ville stige. Genforekomst korrelerer dog ikke nødvendigvis med genekspression; selvom forekomsten af gener forbundet med PPA-metabolisme er højere i kontrolprøver, kan ekspressionsraten derfor være anderledes (Shi et al., 2014). For at bekræfte forholdet mellem forekomsten af PPA-producerende gener og PPA-produktion er der behov for undersøgelser af ekspressionen af gener involveret i PPA-produktion.
Funktionel annotering af PPA- og kontrolmetagenomerne afslørede nogle forskelle. PCA-analyse af genindhold afslørede diskrete klynger mellem PPA- og kontrolprøver (Figur 5). Klyngedannelse inden for prøven afslørede, at kontrolgenindholdet var mere forskelligartet, mens PPA-prøverne klyngede sig sammen. Klyngedannelse efter genindhold var sammenlignelig med klyngedannelse efter artssammensætning. Forskelle i forekomst af pathways er således i overensstemmelse med ændringer i forekomsten af specifikke arter og stammer inden for dem. I PPA-prøver var to pathways med signifikant højere forekomst relateret til aminosukker/nukleotid-sukkermetabolisme (ko:K21279) og flere lipidmetabolisme-pathways (ko:K00647, ko:K03801; Supplerende Tabel 3). Gener forbundet med ko:K21279 vides at være forbundet med slægten Bacteroides, en af slægterne med et signifikant højere antal arter i PPA-prøverne. Dette enzym kan undgå immunresponset ved at udtrykke kapsulære polysaccharider (Wang et al., 2008). Dette kan forklare stigningen i Bacteroidetes observeret hos PPA-eksponerede mus. Dette supplerer den øgede fedtsyresyntese, der observeres i PPA-mikrobiomet. Bakterier bruger FASIIko:K00647 (fabB)-signalvejen til at producere fedtsyrer, hvilket kan påvirke værtens metaboliske veje (Yao og Rock, 2015; Johnson et al., 2020), og ændringer i lipidmetabolismen kan spille en rolle i neurologisk udvikling (Yu et al., 2020). En anden signalvej, der viser øget forekomst i PPA-prøver, var steroidhormonbiosyntese (ko:K12343). Der er voksende beviser for, at der er et omvendt forhold mellem tarmmikrobiotas evne til at påvirke hormonniveauer og til at blive påvirket af hormoner, således at forhøjede steroidniveauer kan have sundhedsmæssige konsekvenser nedstrøms (Tetel et al., 2018).
Denne undersøgelse er ikke uden begrænsninger og overvejelser. En vigtig forskel er, at vi ikke udførte fysiologiske vurderinger af dyrene. Det er derfor ikke muligt direkte at konkludere, om ændringer i mikrobiomet er forbundet med nogen sygdom. En anden overvejelse er, at musene i denne undersøgelse blev fodret med den samme diæt som deres mødre. Fremtidige undersøgelser kan afgøre, om skift fra en PPA-rig diæt til en PPA-fri diæt forbedrer dens virkninger på mikrobiomet. En begrænsning ved vores undersøgelse, ligesom mange andre, er den begrænsede stikprøvestørrelse. Selvom der kan drages valide konklusioner, ville en større stikprøvestørrelse give større statistisk styrke ved analyse af resultaterne. Vi er også forsigtige med at drage konklusioner om en sammenhæng mellem ændringer i tarmmikrobiomet og nogen sygdom (Yap et al., 2021). Forstyrrende faktorer, herunder alder, køn og kost, kan have betydelig indflydelse på sammensætningen af mikroorganismer. Disse faktorer kan forklare de uoverensstemmelser, der er observeret i litteraturen vedrørende sammenhængen mellem tarmmikrobiomet og komplekse sygdomme (Johnson et al., 2019; Lagod og Naser, 2023). For eksempel har medlemmer af slægten Bacteroidetes vist sig at være enten forøgede eller nedsatte hos dyr og mennesker med ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Tilsvarende har studier af tarmsammensætning hos patienter med inflammatoriske tarmsygdomme fundet både stigninger og fald i de samme taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). For at begrænse virkningen af kønsbias forsøgte vi at sikre ligelig repræsentation af kønnene, så forskellene højst sandsynligt var drevet af kosten. En udfordring ved funktionel annotation er fjernelsen af redundante gensekvenser. Vores gendklyngemetode kræver 95 % sekvensidentitet og 85 % længdelighed samt 90 % alignmentdækning for at eliminere falsk klyngedannelse. I nogle tilfælde observerede vi dog COG'er med de samme annotationer (f.eks. MUT) (fig. 6). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om disse ortologer er forskellige, associeret med specifikke slægter, eller om dette er en begrænsning ved genklyngemetoden. En anden begrænsning ved funktionel annotation er potentiel fejlklassificering; det bakterielle gen mmdA er et kendt enzym involveret i propionatsyntese, men KEGG associerer det ikke med propionats metaboliske vej. I modsætning hertil er scpB- og mmcD-ortologerne beslægtede. Det store antal gener uden udpegede knockouts kan resultere i en manglende evne til at identificere PPA-relaterede gener, når man vurderer genforekomsten. Fremtidige undersøgelser vil drage fordel af metatranscriptomanalyse, som kan give en dybere forståelse af tarmmikrobiotas funktionelle egenskaber og forbinde genekspression med potentielle downstream-effekter. For undersøgelser, der involverer specifikke neurologiske udviklingsforstyrrelser eller inflammatoriske tarmsygdomme, er fysiologiske og adfærdsmæssige vurderinger af dyr nødvendige for at forbinde ændringer i mikrobiomets sammensætning med disse lidelser. Yderligere undersøgelser, der transplanterer tarmmikrobiomet til kimfri mus, ville også være nyttige til at bestemme, om mikrobiomet er en driver eller et kendetegn ved sygdom.
Sammenfattende viste vi, at PPA i kosten spiller en rolle i at ændre sammensætningen af tarmmikrobiotaen. PPA er et FDA-godkendt konserveringsmiddel, der findes i vid udstrækning i forskellige fødevarer, og som ved langvarig eksponering kan føre til forstyrrelse af den normale tarmflora. Vi fandt ændringer i forekomsten af adskillige bakterier, hvilket tyder på, at PPA kan påvirke sammensætningen af tarmmikrobiotaen. Ændringer i mikrobiotaen kan føre til ændringer i niveauet af visse metaboliske veje, hvilket kan føre til fysiologiske ændringer, der er relevante for værtens sundhed. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om virkningerne af PPA i kosten på den mikrobielle sammensætning kan føre til dysbiose eller andre sygdomme. Denne undersøgelse lægger grundlaget for fremtidige undersøgelser af, hvordan PPA's virkninger på tarmsammensætningen kan påvirke menneskers sundhed.
Datasættene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige i online repositories. Repositorynavnet og accessionnummeret er: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Dette dyreforsøg blev godkendt af University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (tilladelsesnummer for dyreanvendelse: PROTO202000002). Dette studie overholder lokale love, regler og institutionelle krav.
NG: Konceptualisering, Datakuratering, Formel analyse, Undersøgelse, Metodologi, Software, Visualisering, Skrivning (originalt udkast), Skrivning (gennemgang og redigering). LA: Konceptualisering, Datakuratering, Metodologi, Ressourcer, Skrivning (gennemgang og redigering). SH: Formel analyse, Software, Skrivning (gennemgang og redigering). SA: Undersøgelse, Skrivning (gennemgang og redigering). Overdommer: Undersøgelse, Skrivning (gennemgang og redigering). SN: Konceptualisering, Projektadministration, Ressourcer, Supervision, Skrivning (gennemgang og redigering). TA: Konceptualisering, Projektadministration, Supervision, Skrivning (gennemgang og redigering).
Forfatterne erklærede, at de ikke har modtaget økonomisk støtte til forskningen, forfatterskabet og/eller udgivelsen af denne artikel.
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller økonomiske forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt. Ikke relevant.
Alle meninger udtrykt i denne artikel er udelukkende forfatternes egne og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne hos deres institutioner, udgivere, redaktører eller anmeldere. Produkter, der evalueres i denne artikel, eller påstande fremsat af deres producenter, garanteres eller godkendes ikke af udgiveren.
Supplerende materiale til denne artikel kan findes online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionsyre inducerer gliose og neuroinflammation ved at regulere PTEN/AKT-signalvejen i autismespektrumforstyrrelser. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistisk analyse af sammensætningsdata. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet som risikofaktor for brystkræft. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differentiel ekspressionsanalyse af sekvenstællingsdata. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fækal mikrobiota og metabolomet hos børn med autisme og gennemgribende udviklingsforstyrrelse, ikke andetsteds specificeret. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterielle neurometaboliske karakteristika af tarmmikrobiotaen hos små børn med autismespektrumforstyrrelser. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiomet som et menneskeligt organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nye indsigter i fysiologien af propionsyreproducerende bakterier: Anaerotignum propionicum og Anaerotignum neopropionicum (tidligere Clostridium propionicum og Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Moderens ernæring og fosterudvikling. J Nutr. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., og Hochberg, J. (1995). Kontrol af falsk-positive resultater: En praktisk og effektiv tilgang til multiple tests. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Opslagstidspunkt: 18. april 2025