Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat understøttelse vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
I modsætning til hvirveldyr menes insekter i vid udstrækning at mangle han-biaserede kønssteroidhormoner. Hos Anopheles gambiae ser det ud til, at ecdyson-steroidet 20-hydroxyecdyson (20E) har udviklet sig til at kontrollere ægudviklingen, når det syntetiseres af hunner2, og til at inducere en parringsrefraktær periode, når det overføres seksuelt af hanner3. Da ægudvikling og parring er essentielle reproduktionsegenskaber, kan forståelsen af, hvordan hunlige Anopheles-myg integrerer disse hormonelle signaler, lette designet af nye malariakontrolprogrammer. Her afslører vi, at disse reproduktionsfunktioner reguleres af forskellige kønssteroider gennem et komplekst netværk af ecdysteroid-aktiverende/inaktiverende enzymer. Vi identificerede et han-specifikt oxideret ecdyson, 3-dehydro-20E (3D20E), der beskytter forældreskabet ved at lukke ned for hunners seksuelle modtagelighed efter seksuel overførsel og aktivering ved defosforylering. Bemærkelsesværdigt inducerede 3D20E-overførsel også ekspressionen af ​​reproduktionsgener, der opretholder ægudviklingen under Plasmodium-infektion, hvilket sikrer de inficerede hunners sundhed. Hun-afledt 20E fremkalder ikke en seksuel respons. men tillader parrende individer at lægge æg, efter at 20E-hæmmende kinaser er hæmmet. Identifikationen af ​​dette hanspecifikke insektsteroidhormon og dets rolle i reguleringen af ​​​​hunens seksuelle modtagelighed, fertilitet og interaktion med Plasmodium antyder potentialet for at reducere den reproduktive succes hos malaria-overførende myg.
Malariatilfælde og dødsfald er stigende igen4 på grund af udbredt insekticidresistens hos Anopheles-myg, den eneste vektor for humane malariaparasitter. Parringsbiologien hos disse myg er et særligt attraktivt mål for nye malariabekæmpelsesinterventioner, fordi hunnerne kun parrer sig én gang5; at gøre denne ene parringsbegivenhed steril ville have et stort potentiale til at reducere myggepopulationerne i felten.
Kvinder bliver seksuelt uarbejdsdygtige efter at have modtaget steroidhormoner i høje titre fra mænd. Undersøgelser har vist, at udløseren for vanskeligheder med yderligere parring er 20-hydroxyecdyson (20E), et steroidhormon bedre kendt som en regulator af fældningscyklussen i larvestadiet. Hannernes evne til at syntetisere og overføre 20E har udviklet sig specifikt hos Anopheles-arter, der er en del af underslægten Cellia7, som er udbredt i Afrika og omfatter de farligste vektorer for malaria, herunder Anopheles gambiae. Dette er især bemærkelsesværdigt, fordi hunner hos disse arter også producerer 20E efter hvert blodmåltid, og 20E driver oogenesecyklussen (se ref. 8). Der vides dog kun lidt om, hvordan hunner integrerer signaler fra to forskellige kilder til ecdyson (hannernes overførsel og induktion af blodfødning) uden at kompromittere deres egen evne til at parre sig. Faktisk, hvis den 20E, der produceres af hunnerne, udløser seksuel intolerance, vil dette føre til infertilitet hos individer, der spiser jomfrueligt, en meget almindelig adfærd hos disse myg5.
En mulig forklaring er, at hanner af A. gambiae overfører et modificeret, hanspecifikt ekdyson, som aktiverer en signalkaskade i den kvindelige reproduktionskanal, hvilket resulterer i ustabilitet i parringen. Men selvom hvirveldyr har flere steroidhormoner, såsom østrogen og androgen (gennemgået i ref. 9), er androgen-biasede steroider, så vidt vi ved, ikke blevet identificeret hos insekter.
Vi satte os for at bestemme repertoiret af steroidhormoner i den mandlige accessoriske kirtel (MAG) hos kønsmodne A. gambiae i jagten på mulige modificerende steroider. Ved hjælp af højtydende væskekromatografi koblet med tandemmassespektrometri (HPLC-MS/MS) i stedet for den mindre specifikke metode, der tidligere blev anvendt, detekterede vi ecdyson (E) og 20E i dette væv, hvilket bekræftede det tidligere resultat. Prøven var dog domineret af oxiderede phosphorylerede steroider, hvilket stemmer overens med formlen 3-dehydro-20E-22-phosphat (3D20E22P)12 (Figur 1). Andre former inkluderer 3-dehydro-20E (3D20E) og 20E-22-phosphat (20E22P). HPLC-MS/MS-signalintensiteten af ​​3D20E22P var to størrelsesordener højere end dens dephosphorylerede form, 3D20E, og tre størrelsesordener højere end E og 20E (Figur 1). Selvom det i andre dele af kroppen og ... nedre reproduktionskanal (LRT; Udvidede data fig. 1a). Vi analyserede også ecdysteroider i nyligt lukkede (<1 dag gamle) hanner og hunner og detekterede kun 3D20E og 3D20E22P i MAG; E, 20E og 20E22P var til stede hos begge køn (Udvidede data fig. 1b). Disse data tyder på, at voksne hanner af A. gambiae producerer høje titere af modificerende hormoner i deres MAG'er, som ikke syntetiseres af hunner.
MAG og hun-LRT (inklusive atrier, sædblærer og parovarium) blev dissekeret fra 4 dage gamle (4 dage gamle) jomfruelige hanner og jomfruelige og parrede hunner (0,5, 3 og 12 hpm). Ecdyson i disse væv blev analyseret ved HPLC-MS/MS (gennemsnit ± sem; uparret t-test, tosidet, falsk opdagelsesrate (FDR) korrigeret; NS, ikke signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 timer vs. 0,5 timer, P = 0,035; 12 timer vs. 3 timer, P = 0,0015; 12 timer vs. 0,5 timer, P = 0,030. 3D20E22P: 3 timer vs. 0,5 timer, P = 0,25; 12 timer vs. 3 timer, P = 0,0032; 12 timer vs. 0,5 timer, P = 0,015). Dataene er fra tre biologiske replikater. Toparealet for hvert ecdyson af interesse blev beregnet og normaliseret efter antallet af myg. Ecdyson er repræsenteret ved farve som følger: E, grøn; 20E, orange; 20E22P, lilla; 3D20E, blå; 3D20E22P, pink. Indsætningen øger skalaen på y-aksen for at vise lavere ecdysonniveauer.
For at undersøge om 3D20E22P og 3D20E overføres under parring, dissekerede vi hunlige LRT'er på forskellige tidspunkter efter parring. Selvom ecdyson ikke blev fundet hos jomfruer, observerede vi betydelige mængder af 3D20E22P i LRT'en umiddelbart efter parring (0,5 time efter parring, tpm), hvilket faldt over tid, mens 3D20E-niveauerne steg signifikant (fig. 1). Ved at bruge kemisk syntetiseret 3D20E som standard bestemte vi, at niveauerne af dette steroidhormon i parrings-LRT'er var mindst 100 gange højere end 20E (udvidet datatabel 1). Således er 3D20E22P det primære hanlige ecdyson, der overføres til den kvindelige LRT under parring, og dets defosforylerede form, 3D20E, bliver meget rigelig kort efter parring. Dette antyder en vigtig rolle for sidstnævnte ecdyson i hunnernes biologi efter parring.
Efter at have genereret et nyt RNA-sekventeringsdatasæt (RNA-seq) (fig. 2a) søgte vi ved hjælp af en specialbygget bioinformatisk pipeline efter ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) og ecdysone, der koder for 20E-modificeret fosfatase-gen. EPP) udtrykkes i reproduktive væv. Vi identificerede et kandidat-EPP-gen og to potentielle EcK-gener (EcK1 og EcK2), men kunne ikke finde et godt kandidat-EO-gen. Det er værd at bemærke, at individuelle EPP-gener blev udtrykt i høje niveauer (98,9. percentil) i gambiske MAG'er, men ikke i kvindelige LRT'er (fig. 2b), i modsætning til vores forventninger, da defosforylering af 3D20E22P forekom i dette kvindelige væv. Derfor mener vi, at hanlig EPP kan overføres under parring. Faktisk brugte vi in ​​vivo stabil isotopmærkning til at maskere det kvindelige protein efter parring, et enzym identificeret af MS i det kvindelige atrium (fig. 2c og supplerende tabel 1). Tilstedeværelsen af EPP i MAG og parret (men ikke jomfruelig) hun-LRT blev også bekræftet ved hjælp af specifikke antistoffer (fig. 2d).
a, En specialbygget bioinformatisk pipeline til at søge i reproduktionsvævet hos hvert køn efter gener, der koder for EcK'er, EO'er og EPP'er. Tallene ved siden af ​​pilene angiver antallet af mandlige og kvindelige kandidater i hvert trin. Denne analyse identificerede ét EPP-gen (EPP) og ét EcK-gen (EcK1), der udtrykkes hos hanner, og ét EcK-gen (EcK2), der udtrykkes hos begge køn, men ikke giver et kandidat-EO-gen. b, Heatmap, der sammenligner kandidatgenekspression i jomfrueligt (V) og parringsvæv (M) Anopheles gambiae og Anopheles albicans. Spca, befrugtning; MAG'er, tilbehørskirtler hos hanner; andre dele af kroppen, herunder bryster, vinger, ben, fedtlegemer og indre organer hos begge køn og æggestokke hos hunner. EcK2 udtrykkes i høj grad i både MAG og atrier i Gambia, hvorimod EPP kun findes i MAG.c, Proteomisk analyse af translokation af mandlig ejakulatgruppe til kvindelige atrier ved 3, 12 og 24 hpm, der viser de 67 mest udbredte proteiner. Hunner blev opdrættet på en diæt indeholdende 15N for at mærke (og maskere) alle proteiner. Umærkede hanner blev parret med mærkede hunner, og hunlige LRT'er blev dissekeret ved 3, 12 og 24 hpm til proteomisk analyse (se supplerende tabel 1 for en komplet liste over ejakulationsproteiner). Indsæt, EPP, Eck1 og EcK2 blev detekteret i MAG hos jomfruelige hanner ved proteomisk analyse af disse væv.d, EPP blev detekteret ved western blot i MAG og LRT hos parrede hunner, men ikke hos jomfruelige hunner eller hanner eller resten af ​​​​kvindens krop. Membraner blev samtidigt Undersøgt med anti-actin (indlæsningskontrol) og anti-EPP-antistoffer. Alle mænd er jomfruer. Se supplerende figur 1 for data fra gelkilden. Western blots blev udført to gange med lignende resultater.
EPP's ecdysteroid phosphophosphatase-aktivitet blev verificeret efter inkubation ved HPLC-MS/MS med 3D20E22P isoleret fra MAG (Extended Data Fig. 2a). Da vi desuden dæmpede EPP ved RNA-medieret interferens (RNAi), observerede vi en stærk reduktion i fosfatase-aktivitet i reproduktionsvævet hos disse hanner (Fig. 3a), og hunner parret med EPP-dæmpede hanner viste en signifikant lavere andel af defosforyleret 3D20E (Fig. 3b) på trods af delvis gendæmpning (Extended Data Fig. 2b,c). Derimod observerede vi ikke signifikante ændringer i 20E22P/20E-forholdet hos de samme myg, hvilket kan tyde på, at enzymet er specifikt for 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Nedsat fosfataseaktivitet i MAG forårsaget af EPP-silencing ved brug af dobbeltstrenget EPP RNA (dsEPP) eller dobbeltstrenget GFP RNA (dsGFP) kontroller. Tyve MAG-puljer blev anvendt i hvert replikat (P = 0,0046, parret t-test, tosidet), repræsenteret af separate prikker. b, Hunner parret med EPP-silenced hanner havde en signifikant lavere andel af defosforyleret 3D20E ved 3 hpm (P = 0,0043, uparret t-test, tosidet), hvorimod 20E-niveauerne var upåvirkede (P = 0,063, uparret). t-test, tosidet). Data præsenteres som middelværdi ± sem fra tre puljer med 13, 16 og 19 hunner hver.c, Hunner parret med EPP-silenced hanner havde signifikant højere rater af reparring (P = 0,0002, Fishers eksakte test, tosidet). Hunner blev først tvunget til at parre sig for at sikre deres parringsstatus; 2 dage senere blev de kontaktet med andre hanner med transgen sæd for at vurdere reparringsrater ved kvantitativ PCR-detektion af transgenet.d. Blodfodrede hunner parret med EPP-silenced hanner havde signifikant reduceret fertilitet (P < 0,0001; Mann-Whitney test, tosidet) og et let reduceret antal æg (P = 0,088, Mann-Whitney test, tosidet), mens gydehastigheden ikke var påvirket (P = 0,94, Fishers eksakte test, tosidet). I alle paneler repræsenterer n antallet af biologisk uafhængige myggeprøver.NS, ikke signifikant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Dernæst vurderede vi, om ecdyson-defosforylering er vigtig for at inducere parringsresistens hos hunner. Det er værd at bemærke, at hunner parret med EPP-udtømte hanner genparrede sig med en meget højere frekvens (44,9%) end kontrolhunner (10,4%), når de blev udsat for yderligere (transgene) hanner (fig. 3c). Vi observerede også et signifikant fald i fertiliteten (fig. 3d, venstre) og et lille fald i antallet af æg lagt af disse hunner (fig. 3d, midten), mens procentdelen af ​​æg lagt af hunner (endnu en respons fremkaldt hos hunner ved parring) ikke blev påvirket (fig. 3d, højre). I betragtning af den observerede specificitet af EPP for 3D20E22P tyder disse resultater på, at aktiveringen af ​​3D20E af EPP overført under parring kan spille en vigtig rolle i at deaktivere hunners modtagelighed for yderligere parring, en adfærd, der tidligere blev tilskrevet den seksuelle overførsel af 20E. Derfor påvirker dette hanspecifikke hormon også stærkt hunners fertilitet.
Dernæst sammenlignede vi aktiviteterne af 20E og 3D20E i injektionsforsøg i kønsmodne jomfruer ved hjælp af kemisk syntetiseret 3D20E (fig. 4a-c) og kommercielt tilgængelig 20E. Vi observerede, at 3D20E var signifikant mere effektiv end 20E til at lukke hunnernes følsomhed over for parring ved begge koncentrationer (fig. 4d). Bemærkelsesværdigt nok inducerede halvdelen af ​​det fysiologiske niveau af 3D20E i LRT (1.066 pg efter injektion vs. 2.022 pg efter parring) en andel af refraktære hunner, der var 20 gange højere end det fysiologiske niveau af 20E (361 pg efter injektion) 24 timer efter injektion ved den højeste koncentration 18 pg efter parring; Udvidet datatabel 1). Dette resultat er i overensstemmelse med den antagelse, at seksuel overførsel af 20E ikke forårsager parringsrefraktære perioder, og peger yderligere på 3D20E som en væsentlig faktor i at sikre forældre-barn-forholdet. 3D20E var også signifikant mere aktiv end 20E i æglægningstests hos jomfruhunner (fig. 4e), hvilket tyder på, at den normale æglægningshastighed, vi observerede efter delvis EPP-silencing, skyldtes tilstedeværelsen af ​​resterende 3D20E-aktivitet, der stadig produceres af parringsinducerede hunfaktorer.
(a,b) 3D20E kemisk syntetiseret fra 20E (a) med meget høj konvertering/effektivitet (data præsenteret som middelværdi ± sem fra tre uafhængige syntesereaktioner) (b).c, Massespektrum (nederste halvdel) matcher nøjagtigt ecdyson fundet i parret hun-LRT (øverste halvdel).d, Sammenlignet med 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers eksakte test, tosidet) og 10% ethanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers eksakte test, tosidet), mens 20E kun var signifikant højere end kontrolgruppen ved højere doser (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fishers eksakte test, tosidet).e, 3D20E Injektion inducerede signifikant højere gyderater hos jomfruhunner end 10% ethanol-kontroller (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fishers eksakte test, tosidet), mens 20E kun sammenlignede med kontroller ved højere doser (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fishers eksakte test, tosidet).3D20E inducerede signifikant højere gyderater end 20E ved højere doser (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fishers eksakte test, tosidet). I alle paneler repræsenterer n antallet af biologisk uafhængige myggeprøver. NS, ikke signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Data er fra tre replikater.
I tidligere undersøgelser har vi fastslået, at seksuel overførsel af steroidhormoner inducerer ekspressionen af ​​MISO (Parringsinduceret stimulator af oogenesis 11), et hunligt reproduktionsgen, der beskytter A. gambiae-hunner mod P. falciparum-infektion. Sundhedsomkostninger forårsaget af 13, den dødeligste humane malariaparasit. I betragtning af MISOs betydning for Anopheles' reproduktive fitness i malaria-endemiske områder, besluttede vi at bestemme, hvilket hormon 3D20E eller 20E der udløser ekspressionen af ​​dette gen. Vi fandt, at mens 20E-injektion specifikt eller mere potent inducerede nogle nukleare hormonreceptorer (HR), såsom HR3 og HR4, og typiske downstream steroidmål, såsom de yologeniske gener Vg14, 15, 16, blev MISO kraftigere induceret af 3D20E (Udvidede data fig. 3). Således ser den seksuelle overførsel af dette androgene steroidhormon ud til at inducere mekanismer, der beskytter hunner mod de omkostninger, der er forbundet med parasitinfektion. Desuden påvirker 3D20E differentielt begge isoformer af E-receptoren EcR, hvilket inducerer EcR-A og undertrykker EcR-B, og i højere grad udløser andre parringsinducerende gener, herunder HPX15, som påvirker hunnernes fertilitet. Dette kunne forklare den betydelige infertilitet observeret hos hunner parret med EPP-inaktiverede hanner (Udvidede data fig. 3). Disse data antyder eksistensen af ​​​​downstream-veje, der fortrinsvis aktiveres af to ecdysonhormoner, der kan ligge til grund for kønsspecifik funktion.
Dernæst testede vi funktionen af ​​de to EcK-gener, der er identificeret i vores bioinformatiske pipeline. Silencing af EcK1 eller EcK2 resulterede i betydelig dødelighed hos mænd (Udvidede data fig. 4a), hvilket tyder på, at ecdyson-fosforylering og dermed inaktivering er vigtig for overlevelse. Fordi EcK2 blev udtrykt på højere niveauer end EcK1 og blev detekteret i MAG'er ved proteomics (fig. 2b, c og supplerende tabel 2), validerede vi dens ecdysteroidkinase-aktivitet ved at inkubere den med 20E, hvilket resulterede i fosforylering af 20E22P (Udvidede data figur 2).4b). Ved brug af 3D20E som substrat var vi ikke i stand til at detektere det fosforylerede produkt 3D20E22P (Udvidede data fig. 4c), hvilket tyder på, at 20E snarere end 3D20E kan være det foretrukne mål for EcK2.
Ifølge vores RNA-seq-analyse blev EcK2 også udtrykt i høj grad i LRT hos jomfruhunner, hvor det blev slukket efter parring (fig. 2b). Vi bekræftede disse data og fastslog, at EcK2-ekspressionen ikke var påvirket af blodfodring (udvidede data fig. 5a). Ved at udvide vores indledende MS-eksperimenter fastslog vi, at toppen af ​​20E22P var tæt relateret til toppen af ​​20E (22-26 timer efter blodmåltid; udvidede data fig. 5b). Silencing af EcK2 hos jomfruhunner resulterede i en 3-dobbelt stigning i det relative forhold mellem 20E og 20E22P 26 timer efter blodmåltid (udvidede data figur 2c og 5c), hvilket bekræfter, at EcK2 også phosphorylerer 20E hos hunner. Bemærkelsesværdigt opretholdt EcK2-udtømte jomfruer fuld seksuel modtagelighed (udvidede data fig. 5d,e), hvilket yderligere tyder på, at hunnernes produktion af 20E ikke inducerer parringsrefraktære perioder. Disse hunner havde dog signifikant øgede æglægningsrater sammenlignet med kontrolgruppen, hvor mere end 30 % af jomfruerne lagde æg (Udvidede data fig. 5f). Hvis der blev udført dobbeltstrenget Eck2 RNA (dsEcK2) injektioner efter blodfodring, forekom gydning ikke, hvorefter 20E-toppen på grund af blodindtagelse var faldet. Samlet set understøtter disse resultater en model om, at 20E produceret efter blodsugning kan inducere gydning, men kun når gydeblokken (EcK2 og muligvis andre faktorer) slukkes ved parring. Hverken 20E- eller 3D20E-injektioner hæmmede EcK2-ekspression hos jomfruer (Udvidede data fig. 5g), hvilket tyder på, at andre faktorer medierer hæmningen af ​​denne kinase. Imidlertid var 20E-niveauerne efter blodfodring ikke tilstrækkelige til at inducere parringsubehag, men blev effektivt udløst af høje titere af seksuelt overført 3D20E.
Vores resultater giver vigtig indsigt i de mekanismer, der regulerer A. gambiaes reproduktionssucces. Der er opstået en model, hvor hanner har udviklet sig til at syntetisere høje titere af 3D20E, et hanspecifikt modificeret ecdyson, der sikrer afstamning ved at desensibilisere hunnerne til yderligere parring. Samtidig har disse malariavektorer også udviklet et effektivt system til at aktivere 3D20E hos hunner som reaktion på den seksuelle overførsel af hanspecifik EPP. Så vidt vi ved, er dette det første eksempel på et han- og hundomineret steroidhormonsystem, der udfører en unik og kritisk funktion i insekter. Hanspecifik ecdysonfunktion er blevet postuleret, men ikke endeligt påvist. For eksempel er en stort set modbevist hypotese 18, at disse funktioner kan udføres af 20E-forløberen E1. Det er velkendt, at monandri i Drosophila udløses af den seksuelle overførsel af små kønspeptider 19,20, der interagerer med neuroner, der innerverer den kvindelige reproduktionskanal gennem specifikke kønspeptidreceptorer 21,22. Yderligere arbejde er nødvendigt for at bestemme den downstream-signalering. kaskader kontrolleret af 3D20E hos A. gambiae-hunner og for at bestemme, om disse kaskader kan bevares mellem myg og Drosophila.
I betragtning af den vigtige rolle, som 3D20E spiller for hunners fertilitet og adfærd, som blev identificeret i vores undersøgelse, giver de veje, der fører til 3D20E-syntese og -aktivering, nye muligheder for fremtidige myggebekæmpelsesstrategier, såsom generering af konkurrencedygtige sterile hanner i sterile insektteknologistrategier, der kan bruges til vild frigivelse eller til at imitere 3D20E i jomfruelig leg. Den hanspecifikke funktion af 3D20E kan have udviklet sig, da A. gambiae og andre Cellia-arter fik evnen til at koagulere deres sæd til parringspropper, da dette muliggør effektiv overførsel af et stort antal hormoner og hormonaktiverende enzymer. Til gengæld giver 3D20E-evolution, der implementerer monandry, en mekanisme for hunner (gennem høj ekspression af MISO) til at favorisere deres reproduktive fitness i områder med høj malariaprævalens, hvilket indirekte bidrager til Plasmodium-transmission. I betragtning af at hunlig 20E har vist sig at have dybtgående virkninger på overlevelse og vækst af P. falciparum hos hunlige Anopheles-myg,24 er både mandlige og kvindelige steroidhormonveje nu nøgleaspekter af myg-parasit-interaktioner.
A. gambiae G3-stammer blev opdrættet under standard insektforhold (26-28 °C, 65-80 % relativ luftfugtighed, 12:12 timers lys/mørke-fotoperiode). Larverne blev fodret med pulveriseret fiskefoder (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets og Tetra Pond Sticks i forholdet 7:7:2). Voksne myg blev fodret ad libitum med 10 % dextroseopløsning og ugentligt humant blod (blodkomponenter til undersøgelse). Jomfrumyg blev opnået ved at adskille kønnene i puppestadiet efter at have undersøgt enderne ved mikroskopi. Hanner, der bærer DsRed-transgenet, er tidligere blevet beskrevet.
Tvungen parring blev udført i henhold til tidligere beskrevne protokoller. Til naturlig parring blev 4 dage gamle jomfruhunner holdt i et 1:3-forhold med kønsmodne jomfruhanner i to nætter. I eksperimenter, hvor hanner blev injiceret med dsEPP, faldt co-caging sammen med dag 3-4 efter injektion, hvor fosfataseaktiviteten var maksimalt inaktiveret (Udvidede data fig. 2b).
Myggevæv, resterende kadavere (resten af ​​kroppen) eller hele kroppen blev dissekeret i 100% methanol og homogeniseret med en perlemaskine (2 mm glaskugler, 2.400 rpm, 90 sek). Vævsmængder og metanolvolumener var som følger: resten af ​​kroppen, 50 i 1.000 µl; MAG, 50-100 80 µl; hun-LRT, 25-50 80 µl. Bundfaldet blev underkastet en anden metanolekstraktion med samme volumen methanol. Celleredester blev fjernet ved centrifugering. Metanolen fra begge ekstraktioner blev kombineret og tørret under nitrogenstrøm og derefter resuspenderet i følgende volumener af 80% methanol i vand: resten af ​​kroppen, 50 µl; MAG'er og hun-LRT, 30 µl.
Prøverne blev analyseret på et massespektrometer (ID-X, Thermo Fisher) koblet til et LC-instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl prøve blev injiceret på en 3 µm, 100 × 4,6 mm søjle (Inspire C8, Dikma) holdt ved 25 °C. De mobile faser for LC var A (vand, 0,1% myresyre) og B (acetonitril, 0,1% myresyre). LC-gradienten var som følger: 5% B i 1 minut, derefter øget til 100% B over 11 minutter. Efter 8 minutter ved 100%, genækvilibreres søjlen ved 5% B i 4 minutter. Flowhastigheden var 0,3 ml min-1. Ionisering i MS-kilden udføres ved opvarmet elektrosprayionisering i positive og negative tilstande.
Massespektrometeret måler data i m/z-området fra 350 til 680 ved 60.000 opløsning i fuld MS-tilstand. MS/MS-data blev indsamlet på [M + H]+ (alle mål), [M - H2O + H]+ (alle mål) og [M - H]- (fosforylerede mål). MS/MS-data blev brugt til at bekræfte ecdyson-egenskaberne hos mål, for hvilke der ikke var nogen standard tilgængelig. For at identificere ikke-målrettede ecdysteroider blev MS/MS-data for alle HPLC-toppe med >15% relativ forekomst analyseret. Kvantificer ved hjælp af standardkurver oprettet ud fra rene standarder (20E, 3D20E) for at beregne absolutte mængder eller fortyndinger af en specifik prøve (alle andre mål) for at beregne deres ækvivalens til de mængder, der findes i én han. For 3D20E blev kvantificering udført ved hjælp af summen af ​​følgende addukter: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data blev udvundet og kvantificeret ved hjælp af Tracefinder (version 4.1). MS/MS-data blev analyseret ved hjælp af Xcalibur (version 4.4). MS-spektrene for E, 20E og 3D20E blev sammenlignet med de respektive standarder. 3D20E22P blev analyseret ved derivatisering med Girards reagens. 20E22P blev analyseret ved m/z-forhold.
3D20E22P blev oprenset fra MAG. Oprensning blev udført i analytisk skala ved hjælp af en ultra-performance væskekromatograf (Acquity, Waters) med en quadrupol massebaseret detektor (QDa, Acquity, Waters) under de samme LC-betingelser som HPLC-MS/MS-analysen. Fraktionsopsamling blev udløst, når m/z svarende til 3D20E22P blev detekteret ved samme retentionstid som tidligere bestemt. Renheden af ​​de ekstraherede forbindelser blev derefter kontrolleret ved HPLC-MS/MS som beskrevet ovenfor.
Total RNA blev ekstraheret fra 10-12 reproduktive væv eller andre dele af kroppen (hovedløst) ved hjælp af TRI-reagens (Thermo Fisher) efter producentens instruktioner. RNA blev behandlet med TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA blev syntetiseret ved hjælp af Moloney murine leukæmivirus revers transkriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) efter producentens instruktioner. Primere til kvantitativ PCR til revers transkription (RT-qPCR; Extended Data Table 2) blev tidligere publiceret24 eller designet ved hjælp af Primer-BLAST26, med præference givet til produkter med en størrelse på 70-150 bp og spændende over exon-exon-forbindelser, eller primerparprimere adskiller exoner. cDNA-prøver fra tre til fire biologiske replikater blev fortyndet fire gange i vand til RT-qPCR. Kvantificering blev udført i 15 µl replikatreaktioner indeholdende 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primere og 5 µl fortyndet cDNA. Reaktionerne blev kørt på en QuantStudio 6 Pro realtids-sensor. PCR-system (Thermo Fisher) og data blev indsamlet og analyseret ved hjælp af Design and Analysis (version 2.4.3). Som vist i dette studie blev de relative mængder normaliseret til det ribosomale gen RpL19 (AGAP004422), hvis ekspression ikke ændrede sig signifikant ved blodfodring 27 eller parring 3.
RNA-kvaliteten blev kontrolleret ved hjælp af en Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina parrede biblioteker blev fremstillet og kørt på Broad Institute of MIT og Harvard. Sekventeringslæsninger blev justeret til A. gambiae-genomet (PEST-stamme, version 4.12) ved hjælp af HISAT2 (version 2.0.5) med standardparametre. Læsninger med kortlægningskvalitetsscorer (MAPQ) <30 blev fjernet ved hjælp af Samtools (version 1.3.1). Antallet af læsninger kortlagt til gener blev talt ved hjælp af htseq-count (version 0.9.1) med standardparametre. Normaliserede læsetællinger blev beregnet, og differentiel genekspression blev analyseret ved hjælp af DESeq2-pakken (version 1.28.1) i R (version 4.0.3).
Ecdyson-modificerende genkandidater blev identificeret ved først at søge i A. gambiae-genomet ved hjælp af PSI-BLAST-algoritmen (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ved hjælp af standardværdier Parametre med følgende forespørgselsproteinsekvenser: fra Bombyx mori (accessionsnr. NP_001038956.1), Musca domestica (accessionsnr. XP_005182020.1, XP_005175332.1 og XP_011294434.1) og Microplitis demolitor (accessionsnr. XP_008552646.1 og XP_008552645.1) EcK fra B. mori (accessionsnr. NP_001036900), Drosophila melanogaster (accessionsnr. NP_651202), Apis mellifera (Adgangsnr. XP_394838) og Acyrthosiphon pisum (Adgangsnr. XP_001947166); og EPP fra B. mori (Adgangsnr. XP_001947166) NP_001177919.1 og NP_001243996.1) og EO fra D. melanogaster (Adgangsnr. NP_572986.1) (trin 1). Filtrer derefter hits baseret på høj mRNA-ekspression (>100 fragmenter/kilobase exoner pr. million kortlagte aflæsninger (FPKM) eller >85%) i reproduktionsvæv (kvindelig LRT eller MAG) i Gambia (trin 2). For at forbedre specificiteten udvalgte vi kandidatenzymer, der også udtrykkes i reproduktionsvævet hos A. albimanus, en anopheles-art, der ikke syntetiserer eller overfører ecdyson under parring. Kandidatgener blev filtreret baseret på lav ekspression (<100 FPKM eller <85. percentil) i A. albimanus reproduktionsvæv (trin 3). Som et sidste filter (trin 4) skal kandidatgener opfylde mindst et af følgende: (1) signifikant opreguleret efter parring (P < 0,05) ifølge analysen af ​​differentielt udtrykte gener og (2) i ikke-reproduktivt væv (< 85 % eller <100 FPKM).
Vi modificerede tidligere beskrevne metoder 28,29,30 for at opnå isotopmærkning af hele organismen. Kort fortalt blev vildtype Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) testet i gærnitrogenbase (BD Difco, DF0335) indeholdende (vægt/vol) 2% glukose (G7528, Sigma), 1,7% aminosyrefrit og ammoniumsulfatkulturmedium) og 5% 15N ammoniumsulfat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) som eneste nitrogenkilde. Gær blev udvundet ved centrifugering, og myggelarver blev fodret ad libitum indtil forpupning. Tilskud med fiskemel (0,5 mg pr. 300 larver) for at forhindre dødelighed i fjerde instar. Kun hunner blev derefter brugt i parringsforsøg med umærkede hanner for at analysere det hanlige proteom, der blev overført under parring.
4-6 dage gamle 15N-mærkede jomfruhunner blev tvunget til at parre sig med aldersmatchede, umærkede jomfruhanner. Succesfuld parring blev verificeret ved at detektere parringspropper under epifluorescensmikroskopi. Ved 3, 12 og 24 timer i minuttet blev atrierne hos 45-55 parrede hunner dissekeret i 50 µl ammoniumbicarbonatbuffer (pH 7,8) og homogeniseret med en støder. Homogenatet blev centrifugeret, og supernatanten blev blandet med 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) i 50 mM ammoniumbicarbonat. Supernatanten og pelleten fra hver prøve blev lynfrosset på tøris og sendt natten over til MacCoss-laboratoriet ved University of Washington, hvor prøveforberedelsen til LC-MS/MS blev afsluttet. Resuspender pelleten i 50 µl 0,1% RapiGest i 50 mM ammoniumbicarbonat og soniker i et vandbad. Proteinkoncentrationen af ​​pelleten og supernatanten blev målt ved hjælp af BCA-assay, prøver blev reduceret med 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkyleret med 15 mM iodacetamid (Sigma) og inkuberet ved 37 °C (1:0:50) i 1 time med trypsinisering: trypsin:substratforhold). RapiGest blev lyseret ved tilsætning af 200 mM HCl, efterfulgt af inkubation ved 37 °C i 45 minutter og centrifugering ved 14.000 rpm i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne rester. Prøverne blev vasket ved dual-mode fastfaseekstraktion (Oasis MCX-patroner, Waters) og resuspenderet i 0,1% myresyre for en slutproteinkoncentration på 0,33 µg µl-1. Umærkede MAG-proteomer blev ligeledes analyseret fra jomfruelige hanner. To analytiske replikater blev analyseret for hver prøve. Dernæst blev 1 µg af hver analyseret ved hjælp af en 25 cm smeltet silica 75 μm søjle med en 4 cm smeltet silica Kasil1 (PQ) frittefælde pakket med Jupiter C12 omvendt faseharpiks (Phenomenex) og 180 minutters væskekromatografi. Prøvefordøjelser – MS/MS blev kørt på et Q-Exactive HF massespektrometer (Thermo Fisher) med et nanoACQUITY UPLC System (Waters). Datarelaterede opsamlingsdata genereret for hver kørsel blev konverteret til mzML-format ved hjælp af Proteowizard (version 3.0.20287) og ved hjælp af Comet31 (version 3.2) mod FASTA-databasen indeholdende proteinsekvenser fra Anopheles gambiae (VectorBase version 54), Anopheles coluzzi. En søgning blev udført på Mali-NIH (VectorBase version 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marts 2021), A. gambiae RNA-seq og tre-frame-translationer af kendte humane kontaminanter. Peptidkort-matchede FDR'er blev bestemt ved hjælp af Percolator32 (version 3.05) med en tærskel på 0,01, og peptider blev samlet til proteinidentifikationer ved hjælp af proteinparsimoni i Limelight33 (version 2.2.0). Relativ proteinforekomst blev estimeret ved hjælp af den normaliserede spektrale forekomstfaktor (NSAF) beregnet for hvert protein i hver kørsel som tidligere beskrevet. NSAF i forhold til hvert protein blev gennemsnittet på tværs af prøver fra to forskellige biologiske replikater. 15N-mærkning maskerede med succes det hunlige proteom, selvom en lille mængde umærket protein kunne detekteres fra de mærkede jomfruer. Vi registrerede kun detektion af hanproteinreduktion (1-5 spektre) i hunlige råprøver i tekniske kørsler, hvor råprøver blev kørt efter han-/parringsprøver som følge af HPLC-"carry over". Lejlighedsvise proteiner fundet som 'kontaminanter' fra mærkede jomfruer er anført i supplerende tabel 1.
To antigene peptider, QTTDRVAPAPDQQQ (inden for isotype PA) og MESDGTTPSGDSEQ (inden for isotype PA og PB) i Genscript. De to peptider blev kombineret, derefter konjugeret til bærerproteinet KLH og injiceret i newzealandske kaniner. Kaninerne blev aflivet efter den fjerde injektion, og total IgG blev isoleret ved affinitetsoprensning. IgG fra den mest EPP-specifikke kanin blev brugt til yderligere western blotting.
For western blots, MAG (n = 10, hvor n repræsenterer antallet af biologisk uafhængige myggeprøver) og hun-LRT (n = 30) fra 4 dage gamle jomfruelige hanner og jomfruelige eller tvangsparrede hunner (<10 efter parring), blev proteinekstraktionsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natriumdeoxycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteasehæmmercocktail (Roche)) tilsat separat. Prøverne blev homogeniseret umiddelbart efter dissektion med en perlemaskine (2 mm glasperler, 2.400 rpm, 90 sek). Uopløseligt debris blev fjernet ved centrifugering ved 20.000 g ved 4 °C. Proteiner blev kvantificeret ved Bradford-assay (Bio-Rad). Derefter blev 20 µg MAG-protein, 40 µg LRT-protein og 20 µg resterende bulkprotein denatureret og separeret ved 10% Bis-Tris NuPAGE ved hjælp af MOPS-buffer. Proteiner blev overført til polyvinylidenfluoridmembraner ved hjælp af iBlot2-overføringssystemet (Thermo Fisher). Membranerne blev vasket to gange i 1× PBS-T (0,1% Tween-20 i PBS) og derefter blokeret i Odyssey-blokeringsbuffer (Li-Cor) i 1 time ved 22°C. Membranerne blev rystet natten over ved 4°C med specialfremstillet polyklonalt primært kanin-anti-EPP-antistof (1:700 i blokeringsbuffer) og monoklonalt primært rotte-anti-actin-antistof MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membranerne blev vasket med PBS-T og derefter inkuberet med sekundære antistoffer (æsel-anti-kanin 800CW og ged-anti-rotte 680LT (Li-Cor), begge 1:20.000) i blokeringsbuffer indeholdende 0,01% SDS og 0,2% Tween-20 i 1 time ved 22°C. °C. Membranerne blev vasket med PBS-T og afbildet med en Odyssey CLx-scanner. Billederne blev indsamlet og behandlet i Image Studio (version 5.2). Et specifikt bånd svarende til EPP-RA-isoformen (82 kDa) blev ikke detekteret.
De kodende regioner af EPP (som isoformen AGAP002463-RB indeholdende histidinphosphatasedomæne, NCBI conserved domain search 34) og EcK2 (AGAP002181) blev klonet ind i pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Primere er anført i den udvidede datatabel 2. Otte GS4-linkere (i tandem) blev indsat før det C-terminale 6xHis-mærke i pET-21a(+)-EcK2-konstruktionen. Rekombinante proteiner blev produceret ved hjælp af NEBExpress cellefri E. coli proteinsyntesereaktion (New England BioLabs). Rekombinante proteiner blev oprenset ved hjælp af NEBExpress Ni-spinkolonner (New England BioLabs). Dihydrofolatreduktase (DHFR) kontrolprotein blev produceret ved hjælp af DNA-skabelon fra NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Proteiner blev opbevaret i 50% glycerol i PBS ved -20 °C i op til 3 måneder.
Fosfataseaktiviteten af ​​EPP og vævsekstrakter blev målt ved hjælp af 4-nitrophenylphosphat (pNPP; Sigma-Aldrich). Reaktionsbufferen indeholdt 25 mM Tris, 50 mM eddikesyre, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT. Vævet blev homogeniseret i reaktionsbufferen, og cellerester blev fjernet ved centrifugering. Reaktionen startes ved at tilsætte enzym eller vævsekstrakt til reaktionsbufferen indeholdende 2,5 mg ml-1 pNPP. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i mørke, og mængden af ​​pNP omdannet fra pNPP blev kvantificeret ved at måle absorbansen ved 405 nm på forskellige tidspunkter.
For in vitro EcK-aktivitet blev proteinet inkuberet med 0,2 mg 20E eller 3D20E i 200 µl buffer (pH 7,5) indeholdende 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP og 10 mM MgCl2 i 2 timer ved 27 °C. Reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 800 µl methanol, derefter afkølet ved -20 °C i 1 time og derefter centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten blev derefter analyseret ved HPLC-MS/MS. For at varmeinaktivere de proteiner, der blev anvendt i kontrolgruppen, blev proteinerne inkuberet i 50% glycerol i PBS i 20 minutter ved 95 °C.
For in vitro EPP-aktivitet blev proteinet inkuberet med 3D20E22P (svarende til den mængde, der findes i 18 par MAG, oprenset ved HPLC-MS/MS) i 100 µl buffer (pH 7,5) indeholdende 25 mM Tris, 50 mM eddikesyre, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT i 3 timer ved 27 °C. Reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 400 µl methanol og afkølet ved -20 °C i 1 time og derefter centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten blev analyseret ved HPLC-MS/MS.
PCR-fragmenter for EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) og EcK2 (556 bp) blev amplificeret fra cDNA fremstillet fra myggekadavere uden hoved af blandede køn. PCR-fragmentet af eGFP-kontrollen (495 bp) blev amplificeret fra den tidligere beskrevne pCR2.1-eGFP; PCR-primere er anført i den udvidede datatabel 2. PCR-fragmentet blev indsat mellem de inverterede T7-promotorer på pL4440-plasmidet. Plasmidkonstruktioner blev udvundet fra NEB 5-α-kompetent E. coli (New England Biolabs) og verificeret ved DNA-sekventering før brug (se supplerende data 1 for insertsekvens). Primere matchet til T7-promotoren (udvidet datatabel 2) blev brugt til at amplificere insertet fra det pL4440-baserede plasmid. PCR-produktstørrelsen blev bekræftet ved agarosegelelektroforese. dsRNA blev transkriberet fra PCR-skabeloner ved hjælp af Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) og oprenset i henhold til producentens instruktioner med de tidligere beskrevne modifikationer.
Til dsRNA-injektion blev 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) injiceret i en koncentration på 10 ng nl-1 i thorax hos voksne hanner eller hunner (Nanoject III, Drummond) inden for 1 dag efter eclosion. Gen-knockdown-niveauer blev bestemt i mindst tre biologiske replikater ved RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og RT-qPCR. Til ecdysone-injektion blev 4 dage gamle jomfruelige eller 6 dage gamle jomfruelige blodfodrede hunner injiceret med 0,13, 0,21 eller 0,63 µg 20E eller 3D20E (Nanoject III, Drummond) i koncentrationer på henholdsvis 1,3, 2,1, afhængigt af det eksperimentelle design, eller 6,3 ng nl-1. Injicér 100 nl 10% (vol/vol) ethanol i vand; 100 nl 3D20E22P i 10% ethanol (svarende til 75% af den mængde, der findes i et par MAG'er). Myg blev tilfældigt tildelt injektionsgruppen.
Til gydeforsøg blev 3 dage gamle hunner fodret ad libitum med menneskeblod. Fjern delvist fodrede eller ufodrede myg. Afhængigt af behandlingen blev hunnerne placeret i separate gydekopper i fire nætter mindst 48 timer efter blodmåltidet. Æg blev talt under et stereoskop (Stemi 508, Zeiss); for parrede hunner blev æg, der klækkede til larver, betragtet som fertile.
I parringsforsøg fik hunnerne mindst 2 dage, afhængigt af behandlingen, til at udvikle resistens over for parring, og aldersmatchede vildtype-hanner blev efterfølgende introduceret i samme bur. To nætter senere blev de befrugtede hunner dissekeret, og genomisk DNA blev frigivet ved frysning-optøning og sonikering i en buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA og 25 mM NaCl (pH 8,2). Prøverne blev inkuberet med Proteinase K (0,86 µg µl-1) i 15 minutter ved 55 °C, efterfulgt af 10 minutter ved 95 °C. Rå genomisk DNA-præparater blev fortyndet 10 gange og underkastet qPCR-detektion af Y-kromosomsekvenser; primere er anført i den udvidede datatabel 2. Fravær af Y-kromosomsekvens indikerer ingen parring.
Til genparringsanalyser blev tvangsparrede hunner undersøgt for tilstedeværelsen af ​​parringspropper for at bekræfte parringsstatus og fik lov til at udvikle refraktæritet over for parring i fravær af hanner, som tidligere beskrevet36. Hanner, der bar DsRed transgen sæd, blev derefter introduceret i hunnernes bure. To nætter senere blev de befrugtende vesikler dissekeret fra hunnerne, og genomisk DNA blev fremstillet som beskrevet ovenfor og underkastet qPCR-detektion af DsRed-transgenet; primere er anført i den udvidede datatabel 2. Fraværet af DsRed-transgenet indikerede, at der ikke forekom nogen genparring.
3D20E blev syntetiseret som tidligere beskrevet 37. Kort fortalt blev 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) opløst i 10 ml vand, efterfulgt af tilsætning af 30 mg platinsort (i pulverform, Sigma-Aldrich). En blid strøm af O2 blev kontinuerligt boblet ind i reaktionsblandingen, som blev omrørt ved stuetemperatur. Efter 6 timer blev 30 ml methanol tilsat for at stoppe reaktionen. Blandingen blev centrifugeret for at fjerne katalysatorpartikler. Supernatanten blev inddampet til tørhed i vakuum ved stuetemperatur. Det tørrede reaktionsprodukt blev opløst i 10% ethanol og methanol til injektion til HPLC-MS/MS-analyse. Konverteringshastigheden (fra 20E til 3D20E) var ca. 97% (fig. 4b), og MS-spektret for det syntetiserede 3D20E matchede det, der blev fundet hos parrede hunner (fig. 4c).
Legenden indeholder specifikke detaljer om de udførte statistiske tests. GraphPad (version 9.0) blev brugt til at udføre Fishers eksakte test, Mantel-Cox-test og Students t-test. Cochran-Mantel-Haenszel-tests blev udført ved hjælp af et brugerdefineret R-script (tilgængelig på https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Datafordelingen blev testet for normalitet ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen med en signifikansgrænse på 0,05. Når dataene ikke bestod normalitetstesten, blev Mann-Whitney-testen udført. Overlevelsesdata blev analyseret ved hjælp af Mantel-Cox-testen. DESeq2-pakken (version 1.28.1) blev brugt til at udføre RNA-seq-genniveau differentiel ekspressionsanalyse. Den vandrette bjælke på grafen repræsenterer medianen. En signifikansværdi på P = 0,05 blev brugt som tærskel for alle tests.
For mere information om studiedesignet, se Nature Research Report-resuméet, der er linket til denne artikel.
MS proteomdata blev deponeret i ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) med datasæt-id'et PXD032157.
RNA-seq-datasættet er deponeret i Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under serienummeret GSE198665.
Yderligere datasæt genereret og/eller analyseret under den aktuelle undersøgelse kan fås fra de tilsvarende forfattere efter rimelig anmodning. Denne artikel angiver kildedataene.
De Loof, A. Ekdysteroider: Forsømte insektkønssteroider? Mandlig: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdyson og ovarieudvikling hos Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).