Javascript er i øjeblikket deaktiveret i din browser. Nogle funktioner på denne hjemmeside fungerer ikke, når javascript er deaktiveret.
Registrer dig med dine specifikke oplysninger og det specifikke lægemiddel, du er interesseret i, så matcher vi de oplysninger, du giver, med artikler i vores omfattende database og sender dig straks en PDF-kopi via e-mail.
Ban-Lan-Gen-granuler dæmper dextran-natriumsulfat-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus ved at modulere tarmmikrobiota og genoprette intestinal SCFA-afledt GLP-1-produktion
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao 21 Peking Universitetshospital, Institut for Farmaceutisk Produktion, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 2 Shenzhen Universitets Sundhedsvidenskabelige Center, Farmaceutisk Fakultet, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 3 Guizhou Medical University, Center for Ingeniørteknologisk Forskning for Etnisk Medicin og Traditionel Kinesisk Medicin, Udvikling og Anvendelse, Undervisningsministeriet, Guizhou Provincial Key Laboratory of Farmaceutical, Guizhou Medical University, Guiyang, Folkerepublikken Kina; 4 Institut for Gastroenterologi, Peking Universitetshospital, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 5 Farmaceutisk Fakultet, Guizhou Medical University, Statens Key Laboratorium for Lægeplanters Funktion og Anvendelse, Guiyang; 6 Institut for Laboratoriemedicin, Peking Universitet Shenzhen Hospital, Shenzhen, Kina [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutisk Fakultet, Guizhou Medical University, Guizhou, Folkerepublikken Kina, 550004, E-mail [email protected] Formål: GLP-1-baseret terapi er en ny behandlingsmulighed for inflammatorisk tarmsygdom. Ban-Lan-Gen (BLG) granulat er en kendt antiviral TCM-formulering, der udviser potentiel antiinflammatorisk aktivitet i behandlingen af ​​forskellige inflammatoriske tilstande. Dens antiinflammatoriske effekt på colitis og dens virkningsmekanisme er dog stadig uklar. METODER: At fastslå dextran-natriumsulfat (DSS)-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus. Sygdomsaktivitetsindekser, histologiske markører for skade og proinflammatoriske cytokinniveauer blev udført for at vurdere den beskyttende effekt af BLG. Virkningerne af BLG på tarmmikrobiotaen og tarmen blev karakteriseret ved serum GLP-1-niveauer og kolon Gcg-, GPR41- og GRP43-ekspression, tarmmikrobiotasammensætning, fækale SCFA-niveauer og GLP-1-frigivelse fra Produktion af primære musekolonepitelceller SCFA-afledt GLP-1. Resultater: BLG-behandling reducerede signifikant kropsvægttab, DAI, kolonforkortning, kolonvævsskade og proinflammatoriske cytokinniveauer af TNF-α, IL-1β og IL-6 i kolonvæv. Derudover kan BLG-behandling signifikant genoprette ekspressionen af ​​Gcg, GPR41 og GRP43 i kolon og serum-GLP-1-niveauer hos colitis-mus ved at øge SCFA-producerende bakterier såsom Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001 og reducere mængden af ​​bakterier såsom Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas og Oscillibacter. Derudover kan BLG-behandling signifikant øge niveauet af SCFA'er i fæces fra colitis-mus. Samtidig viste in vitro-forsøg også, at fækalekstraktet fra BLG-behandlede mus i høj grad kan stimulere de primære små murine kolonepitelceller, der udskiller GLP-1. Konklusioner: Disse fund tyder på, at BLG har en anti-colitis-effekt. BLG har potentiale til at blive udviklet som en terapi, i det mindste delvist ved at modulere tarmmikrobiotaen og genoprette intestinal SCFA-afledt GLP-1-produktion. Lovende lægemidler til kronisk recidiverende colitis. Nøgleord: colitis, Ban-Lan-Gen-granuler, tarmmikrobiota, kortkædede fedtsyrer, GLP-1
Ulcerativ colitis (UC) er en langvarig inflammatorisk sygdom i tyktarmen og endetarmen, der er karakteriseret ved tilbagevendende diarré, mavesmerter, vægttab og mukopurulent blodig afføring.1 For nylig er prævalensen af ​​UC steget i lande med tidligere lav incidens, herunder Kina, med den stigende popularitet af vestlig livsstil.2 Denne stigning udgør store problemer for folkesundheden og har alvorlige konsekvenser for patienters arbejdsevne og livskvalitet. Især patogenesen af ​​UC forbliver stort set uklar, men det er generelt accepteret, at genetik, miljøfaktorer, tarmmikrobiotaen og immunsystemet alle bidrager til udviklingen af ​​UC.3 Selv nu er der ingen kur mod UC, og målet med behandlingen er klinisk at kontrollere kliniske symptomer, inducere og opretholde remission, fremme slimhindeheling og reducere tilbagefald. Klassiske behandlinger omfatter aminosalicylater, kortikosteroider, immunsuppressive midler og biologiske lægemidler. Disse lægemidler kan dog ikke opnå den ønskede effekt på grund af deres forskellige bivirkninger.4 For nylig har mange casestudier vist, at traditionel kinesisk medicin (TCM) har vist et stort potentiale til at hjælpe at lindre UC med lav toksicitet, hvilket tyder på, at udviklingen af ​​nye TCM-terapier er en lovende behandlingsstrategi for UC.5-7
Banlangen Granules (BLG) er et traditionelt kinesisk medicinpræparat fremstillet af vandekstraktet fra Banlangen-rod.8 Ud over sin antivirale virkning udviser BLG potentiel antiinflammatorisk aktivitet i behandlingen af ​​forskellige inflammatoriske tilstande.9,10 Derudover er glucosinolater (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin og glucosid blevet isoleret og identificeret fra vandige ekstrakter af Radix isatidis) og nukleosider (hypoxanthin, adenosin, uridin og guanosin) og indigoalkaloider såsom indigo og indirubin.11,12 Tidligere undersøgelser har veldokumenteret, at forbindelserne adenosin, uridin og indirubin udviser potente anti-colitis-effekter i forskellige dyremodeller af colitis.13-17 Der er dog ikke udført evidensbaserede undersøgelser for at evaluere BLG's effektivitet ved colitis. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi den beskyttende effekt af BLG på dextran-natriumsulfat (DSS)-induceret kronisk tilbagefaldende colitis hos C57BL/6-mus. og fandt, at oral administration af BLG signifikant dæmpede DSS-induceret kronisk recidiverende tyktarmsinflammation hos mus. Dens reguleringsmekanismer er forbundet med modulering af tarmmikrobiota og genoprettelse af tarmafledt glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) produktion.
BLG-granulat (sukkerfrit, NMPA-godkendt Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, Kina; batchnummer: 20110966) blev købt fra apoteker. DSS (molekylvægt: 36.000-50.000 Dalton) blev købt fra MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazin (SASP) (≥ 98% renhed), hæmatoxylin og eosin blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Mus TNF-α, IL-1β og IL-6 luminex Elisa assay kits blev købt fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Eddikesyre, propionsyre og smørsyre blev købt fra Aladdin Industries (Shanghai, Kina). 2-ethylsmørsyre blev købt fra Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland).
6-8 uger gamle hanmus af typen C57BL/6 (kropsvægt 18-22 g) blev købt fra Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, Kina) og holdt i et miljø på 22 ± 2 °C med en 12 timers lys/mørke-cyklus. Musene fik en standard gnaverdiæt med fri adgang til drikkevand i en uge for at vænne sig til det nye miljø. Musene blev derefter tilfældigt opdelt i fire grupper: kontrolgruppe, DSS-modelgruppe, SASP-behandlet gruppe (200 mg/kg, oralt) og BLG-behandlet gruppe (1 g/kg, oralt). Som vist i figur 1A blev eksperimentel kronisk recidiverende colitis induceret hos mus ved tre cyklusser med 1,8 % DSS i 5 dage, efterfulgt af destilleret vand i 7 dage, ifølge vores tidligere undersøgelse.18 Mus i de SASP- og BLG-behandlede grupper blev behandlet med henholdsvis SASP og BLG hver dag startende fra dag 0. Ifølge foreløbige eksperimenter blev dosis af BLG blev sat til 1 g/kg. I mellemtiden blev dosis af SASP sat til 200 mg/kg i henhold til litteraturen.4 Kontrol- og DSS-modelgrupperne modtog den samme mængde vand under hele eksperimentet.
Figur 1 BLG lindrer DSS-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus. (A) Eksperimentelt design af kronisk recidiverende colitis og behandling, (B) ændring i kropsvægt, (C) sygdomsaktivitetsindeks (DAI) score, (D) tyktarmslængde, (E) repræsentativt billede af tyktarmen, (F) H&E-farvning af tyktarmen (forstørrelse, ×100) og (G) histologisk score. Data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 vs. kontrolgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs. DSS-gruppe.
Kropsvægt, afføringskonsistens og rektal blødning blev registreret dagligt. Sygdomsaktivitetsindekset (DAI) blev bestemt ved at kombinere scorer for kropsvægt, afføringskonsistens og rektal blødning som tidligere beskrevet.19 Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev alle mus aflivet, og blod, afføring og tyktarm blev opsamlet til yderligere eksperimenter.
Kolonvæv blev formalinfikseret og indlejret i paraffin. 5-mikron snit blev lavet og farvet med hæmatoxylin-eosin (H&E), derefter blindet og scoret som tidligere beskrevet.19
Total RNA fra tyktarmsvæv blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), efterfulgt af cDNA-ekstraktion med revers transkriptase (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kvantitativ PCR blev udført ved hjælp af et realtids-PCR-system med SYBR Green Master (Roche, Basel, Schweiz). Målgentranskripter blev normaliseret til β-actin, og data blev analyseret ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden. Genprimersekvenserne er vist i tabel 1.
Primær isolering og dyrkning af musekolonepitelceller blev udført som tidligere beskrevet.20 Kort fortalt blev koloner fra 6-8 uger gamle mus først udskåret efter aflivning ved cervikal dislokation, derefter åbnet i længderetningen, behandlet med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, uden calcium og magnesium) og skåret i 0,5-1 mm små stykker. Derefter blev vævene fordøjet med 0,4 mg/ml kollagenase XI (Sigma, Poole, UK) i frit DMEM-medium og centrifugeret ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender pelleten i DMEM-medium (suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin) ved 37 °C og ført gennem et nylonnet (porestørrelse ~250 µm). Alikvoter af kolonepitelceller blev placeret i skåle med glasbund og inkuberet med eddikesyre, propionsyre, smørsyre og muse- fækale ekstrakter i 2 timer ved 37°C, 5% CO2.
Tyktarmsvæv blev homogeniseret med PBS, og niveauerne af cytokinerne IL-6, TNF-α og IL-1β i tyktarmsvæv blev detekteret ved hjælp af luminex ELISA-assay-kits (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Ligeledes blev GLP-1-niveauer i serum og dyrkningsmedium fra primære murine kolonepitelceller bestemt med et ELISA-kit (Bioswamp, Wuhan, Kina) i henhold til producentens instruktioner.
Totalt DNA fra afføring blev ekstraheret ved hjælp af et DNA-ekstraktionskit (Tiangen, Kina). Kvaliteten og mængden af ​​DNA blev målt i forholdet 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm, henholdsvis. Efterfølgende blev de specifikke primere 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) og 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) anvendt til at amplificere V3-V4-regionerne af 16S rRNA-genet i forskellige regioner ved hjælp af hvert ekstraheret DNA som skabelon. PCR-produkter blev oprenset ved hjælp af QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland), kvantificeret ved realtids-PCR og sekventeret ved hjælp af IlluminaMiseq PE300-sekventeringsplatformen (Illumina Inc., CA, USA). Til bioinformatisk analyse blev databehandling udført i henhold til tidligere rapporterede protokoller.21,22 Kort sagt, brug Cutadapt (V1.9.1) til at filtrere rå expressfiler. OTU'er blev grupperet ved hjælp af UPARSE (version 7.0.1001) med en similaritetsgrænse på 97%, og UCHIME blev brugt til at fjerne kimære sekvenser. Analyse og klassificering af fællesskabssammensætning blev udført ved hjælp af RDP-klassifikatoren (http://rdp.cme.msu.edu/) baseret på SILVA ribosomalt RNA-gendatabasen.
Niveauer af kortkædede fedtsyrer (eddikesyre, propionsyre og smørsyre) blev målt som tidligere beskrevet af Tao et al., med nogle ændringer.23 Kort fortalt blev 100 mg fæces først suspenderet i 0,4 ml deioniseret vand, efterfulgt af 0,1 ml 50% svovlsyre og 0,5 ml 2-ethylsmørsyre (intern standard), derefter homogeniseret og opvarmet ved 4°C. Centrifuger ved 12.000 o/min i 15 minutter ved C. Supernatanten blev ekstraheret med 0,5 ml ether og injiceret i GC'en til analyse. Til gaskromatografi (GC)-analyse blev prøverne analyseret ved hjælp af en GC-2010 Plus gaskromatograf (Shimadzu, Inc.) udstyret med en flammeioniseringsdetektor (FID). Separation blev opnået ved hjælp af en ZKAT-624-søjle, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kina). Data blev indsamlet ved hjælp af GC-løsningssoftware (Shimadzu, Inc.). Delingsforholdet var 10:1, bærergassen var nitrogen, og flowhastigheden var 6 ml/min. Injektionsvolumenet var 1 μL. Injektor- og detektortemperaturen var 300 °C. Ovntemperaturen blev holdt ved 140 °C i 13,5 minutter og derefter øget til 250 °C med en hastighed på 120°C/min; temperaturen blev holdt i 5 minutter.
Data præsenteres som middelværdi ± standardfejl for middelværdien (SEM). Datasignifikans blev vurderet ved envejs ANOVA efterfulgt af Duncans multiple range test. GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) blev anvendt til alle beregninger, og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Det er velkendt, at UC er en kronisk recidiverende colitis-sygdom med svære mavesmerter, diarré og blødning. Derfor blev DSS-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus etableret for at evaluere BLG's anti-colitis-effektivitet (fig. 1A). Sammenlignet med kontrolgruppen havde mus i DSS-modelgruppen signifikant reduceret kropsvægt og højere DAI, og disse ændringer var signifikant reverseret efter 24 dages BLG-behandling (figur 1B og C). Kolonforkortning er et vigtigt kendetegn ved UC. Som vist i figur 1D og E var kolonlængderne hos mus, der modtog DSS, signifikant forkortet, men blev lindret af BLG-behandling. Efterfølgende blev histopatologisk analyse udført for at vurdere koloninflammation. H&E-farvede billeder og patologiske scorer viste, at DSS-administration signifikant forstyrrede kolonarkitekturen og resulterede i kryptødelæggelse, hvorimod BLG-behandling signifikant reducerede kryptødelæggelse og patologiske scorer (figur 1F og G). Bemærkelsesværdigt var den beskyttende effekt af BLG ved en dosis på 1 g/kg sammenlignelig med SASP ved en dosis på 200 mg/kg. Samlet set tyder disse fund på, at BLG er effektivt til at reducere sværhedsgraden af ​​DSS-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus.
TNF-α, IL-1β og IL-6 er vigtige inflammatoriske markører for inflammation i tyktarmen. Som vist i figur 2A inducerede DSS en signifikant stigning i genekspressionen af ​​TNF-α, IL-1β og IL-6 i tyktarmen sammenlignet med kontrolgruppen. Administration af BLG kan signifikant vende disse DSS-medierede ændringer. Dernæst brugte vi ELISA til at bestemme niveauerne af de inflammatoriske cytokiner TNF-α, IL-1β og IL-6 i tyktarmsvæv. Resultaterne viste også, at kolonniveauerne af TNF-α, IL-1β og IL-6 var signifikant forhøjede hos mus behandlet med DSS, hvorimod BLG-behandling afhjælpede disse stigninger (figur 2B).
Figur 2. BLG hæmmer genekspression og produktion af de proinflammatoriske cytokiner TNF-α, IL-1β og IL-6 i tyktarmen hos DSS-behandlede mus. (A) Kolonisk genekspression af TNF-α, IL-1β og IL-6; (B) Koloniske proteinniveauer af TNF-α, IL-1β og IL-6. Data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 4-6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 vs. kontrolgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 vs. DSS-gruppe.
Intestinal dysbiose er kritisk i patogenesen af ​​UC.24 For at undersøge, om BLG modulerer tarmmikrobiotaen hos DSS-behandlede mus, blev 16S rRNA-sekventering udført for at analysere det bakterielle samfund i tarmindholdet. Venn-diagrammet viser, at de tre grupper deler 385 OTU'er. Samtidig havde hver gruppe unikke OTU'er (fig. 3A). Desuden viste Chao1-indekset og Shannon-indekset vist i figur 3B og C, at tarmmikrobiotaens samfundsdiversitet var reduceret i BLG-behandlede mus, da Shannon-indekset var signifikant reduceret i den BLG-behandlede gruppe. Principal component analysis (PCA) og principal coordinate analysis (PCoA) blev brugt til at bestemme klyngemønstre blandt de tre grupper og viste, at samfundsstrukturen hos DSS-behandlede mus var tydeligt adskilt efter BLG-behandling (figur 3D og E). Disse data tyder på, at BLG-behandling signifikant påvirkede samfundsstrukturen hos mus med DSS-induceret colitis.
Figur 3. BLG ændrer diversiteten af ​​tarmmikrobiota hos mus med DSS-induceret colitis. (A) Venn-diagram for OTU, (B) Chao1-indeks, (C) Shannons richness-indeks, (D) Principal Component Analysis (PCA) scoreplot for OTU, (E) OTU Principal Coordinate Analysis (PCoA) scorefigur. Data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs. DSS-gruppe.
For at vurdere specifikke ændringer i den fækale mikrobiota analyserede vi sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen på alle taksonomiske niveauer. Som vist i figur 4A var de primære rækker i alle grupper Firmicutes og Bacteroidetes, efterfulgt af Verrucomicrobia. De relative forekomster af Firmicutes og Firmicutes/Bacteroidetes-forhold var signifikant forøget i de fækale mikrobielle samfund hos DSS-behandlede mus sammenlignet med kontrolmus, og disse ændringer blev signifikant reverseret efter BLG-behandling. Især øgede BLG-behandling signifikant den relative forekomst af Verrucobacterium i fæces hos mus med DSS-induceret colitis. På husstandsniveau var de fækale mikrobielle samfund optaget af Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae og Prevotellaceae (fig. 4B). Sammenlignet med DSS-gruppen øgede reduktionen af ​​BLG forekomsten af ​​Akkermansiaceae, men mindskede forekomsten af ​​Lachnospiraceae og Ruminococcaceae. Bemærkelsesværdigt, på slægtsniveau, Den fækale mikrobiota var optaget af Lachnospira_NK4A136_gruppen, Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001 (fig. 4C). Dette fund viste også, at BLG-behandling effektivt vendte mikrobiota-ubalancen som reaktion på DSS-belastning, karakteriseret ved et fald i Eubacterium_xylanophilum_gruppen, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas og Oscillibacter, og en stigning i Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001.
Figur 4 BLG ændrer forekomsten af ​​tarmmikrobiota hos DSS-inducerede colitis-mus. (A) Forekomst af tarmmikrobiota på rækkeniveau; (B) Forekomst af tarmmikrobiota på familieniveau; (C) Forekomst af tarmmikrobiota på slægtsniveau. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ###p < 0,001 vs. kontrolgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs. DSS-gruppe.
I betragtning af at kortkædede fedtsyrer (SCFA'er) er de vigtigste metabolitter af Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001, mens acetat, propionat og butyrat er de mest udbredte SCFA'er i tarmlumen,25-27 er vi stadig i vores undersøgelse. Som vist i figur 5 var koncentrationerne af acetat, propionat og butyrat i fæces signifikant reduceret i den DSS-behandlede gruppe, mens BLG-behandling i vid udstrækning kunne undertrykke denne reduktion.
Figur 5. BLG øger niveauet af SCFA'er i fæces fra mus med DSS-induceret colitis. (A) Eddikesyreindhold i fæces; (B) propionsyreindhold i fæces; (C) smørsyreindhold i fæces. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs. kontrolgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 vs. DSS-gruppe.
Vi beregnede yderligere Pearson-korrelationskoefficienten mellem differentiel SCFA på slægtsniveau og fækal mikrobiota. Som vist i figur 6 var Akkermansia positivt korreleret med produktionen af ​​propionsyre (Pearson = 0,4866) og smørsyre (Pearson = 0,6192). I modsætning hertil var både Enteromonas og Oscillobacter negativt associeret med acetatproduktion, med Pearson-koefficienter på henholdsvis 0,4709 og 0,5104. Ligeledes var Ruminococcaceae_UCG-014 negativt korreleret med produktionen af ​​propionsyre (Pearson = 0,4508) og smørsyre (Pearson = 0,5842).
Figur 6 Pearson korrelationsanalyse mellem differentielle kortsluttede fettsyrer (SCFA'er) og kolonmikrober. (A) Enteromonas med eddikesyre; (B) Hjernerystelsesbacillus med eddikesyre; (C) Akkermansia vs. propionsyre; (D) Ruminococcus_UCG-014 med propionsyre; (E) Akkermansia med smørsyre; (F) Ruminococcus _UCG-014 med smørsyre.
Glucagonlignende peptid-1 (GLP-1) er et celletypespecifikt posttranslationelt produkt af proglucagon (Gcg) med antiinflammatoriske egenskaber.28 Som vist i figur 7 inducerede DSS et signifikant fald i Gcg mRNA-ekspression. Kolon- og BLG-behandling kunne signifikant reversere den DSS-inducerede Gcg-reduktion sammenlignet med kontrolgruppen (figur 7A). Samtidig var niveauet af GLP-1 i serum signifikant reduceret i den DSS-behandlede gruppe, og BLG-behandling kunne i vid udstrækning forhindre denne reduktion (figur 7B). Da kortkædede fedtsyrer kan stimulere GLP-1-sekretion gennem aktivering af G-proteinkoblet receptor 43 (GRP43) og G-proteinkoblet receptor 41 (GRP41), undersøgte vi også GPR41 og GRP43 i tyktarmen hos colitis-mus og fandt, at den koloniske mRNA-ekspression af GRP43 og GPR41 var signifikant reduceret efter DSS-provokation, og BLG-behandling kunne effektivt redde disse fald (figur 7C og D).
Figur 7. BLG øger serum-GLP-1-niveauer og kolonisk Gcg-, GPR41- og GRP43 mRNA-ekspression hos DSS-behandlede mus. (A) Gcg mRNA-ekspression i tyktarmsvæv; (B) GLP-1-niveau i serum; (C) GPR41 mRNA-ekspression i tyktarmsvæv; (D) GPR43 mRNA-ekspression i tyktarmsvæv. Data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 5-6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs. kontrolgruppe (Con-gruppe); *p < 0,05 vs. DSS-gruppe.
Da BLG-behandling kunne øge serum-GLP-1-niveauer, kolon-Gcg mRNA-ekspression og fækale SCFA-niveauer hos DSS-behandlede mus, undersøgte vi yderligere acetat, propionat og butyrat samt fra kontrol (F-Con), DSS-colitis (F-Con)-DSS) og BLG-behandlede colitis (F-BLG) mus vedrørende frigivelsen af ​​GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller. Som vist i figur 8A stimulerede primære muse-kolonepitelceller behandlet med henholdsvis 2 mM eddikesyre, propionsyre og smørsyre signifikant frigivelsen af ​​GLP-1, hvilket stemmer overens med tidligere undersøgelser.29,30 Ligeledes stimulerede alle F-Con, F-DSS og F-BLG (svarende til 0,25 g fæces) i høj grad frigivelsen af ​​GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller. Bemærkelsesværdigt var mængden af ​​GLP-1 frigivet af F-DSS-behandlede primære muse-kolonepitelceller meget lavere end mængden af ​​F-Con. og F-BLG-behandlede primære musekolonepitelceller (Figur 8B). Disse data tyder på, at BLG-behandling signifikant genoprettede intestinal SCFA-afledt GLP-1-produktion.
Figur 8 BLG-afledt SCFA stimulerer frigivelsen af ​​GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller. (A) Eddikesyre, propionsyre og smørsyre stimulerede frigivelsen af ​​GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller; (B) fækale ekstrakter F-Con, F-DSS og F-BLG stimulerede primære murine kolonepitelceller. Mængden af ​​frigivet GLP-1. Portioner af kolonepitelceller blev placeret i petriskåle med glasbund og behandlet med henholdsvis 2 mM eddikesyre, propionsyre, smørsyre og fækale ekstrakter F-Con, F-DSS og F-BLG (svarende til 0,25 g fæces). 2 timer ved 37°C, 5% CO2, henholdsvis. Mængden af ​​GLP-1 frigivet fra primære murine kolonepitelceller blev detekteret ved ELISA. Data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 3). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs. blank eller F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Forkortelser: Ace, eddikesyre; Pro, propionsyre; dog smørsyre; F-Con, fækalt ekstrakt fra kontrolmus; F-DSS, fækalt ekstrakt fra colitis-mus; F-BLG, fra BLG-behandlet tyktarm. Fækale ekstrakter fra inflammatoriske mus.
Colitis ulcerosa, der er opført af Verdenssundhedsorganisationen som en refraktær sygdom, er ved at blive en global fare; Effektive metoder til at forudsige, forebygge og behandle sygdommen er dog stadig begrænsede. Derfor er der et presserende behov for at udforske og udvikle nye sikre og effektive terapeutiske strategier for UC. Traditionelle kinesiske medicinpræparater er en lovende mulighed, fordi mange traditionelle kinesiske medicinpræparater har vist sig at være effektive i behandlingen af ​​UC i den kinesiske befolkning gennem århundreder, og de er alle biologiske, organiske stoffer og naturlige materialer, der for det meste er harmløse for mennesker og dyr.31,32 Denne undersøgelse havde til formål at søge et sikkert og effektivt traditionelt kinesisk medicinpræparat til behandling af UC og at udforske dets virkningsmekanisme. BLG er en velkendt kinesisk urteformel, der bruges til at behandle influenza.8,33 Arbejde i vores laboratorium og andre har vist, at indigo, et forarbejdet traditionelt kinesisk medicinprodukt fra samme råmateriale som BLG, udviser betydelig effekt i behandlingen af ​​UC hos mennesker og dyr.4,34 Imidlertid er BLG's anti-colitis-effekter og dens virkninger Mekanismen uklar. I den aktuelle undersøgelse viser vores resultater, at BLG effektivt dæmper DSS-induceret koloninflammation, som er forbundet med modulering af tarmfunktionen. mikrobiota og genoprettelse af tarmafledt GLP-1-produktion.
Det er velkendt, at UC er karakteriseret ved tilbagefaldsperioder med typiske kliniske træk, såsom vægttab, diarré, rektal blødning og omfattende skader på tyktarmens slimhinde.35 Kronisk tilbagefaldende colitis blev således administreret ved at administrere tre cyklusser med 1,8% DSS i fem dage, efterfulgt af syv dages drikkevand. Som vist i figur 1B indikerede fluktuerende vægttab og DAI-scorer vellykket induktion af kronisk tilbagefaldende colitis. Mus i gruppen behandlet med BLG viste opadgående bedring fra dag 8, hvilket var signifikant forskelligt fra dag 24. De samme ændringer blev også observeret i DAI-scoren, hvilket tyder på en forbedring i den kliniske forbedring af colitis. Med hensyn til tyktarmsskade og inflammatorisk status blev tyktarmslængde, tyktarmsvævsskade og genekspression og produktion af de proinflammatoriske cytokiner TNF-α, IL-1β og IL-6 i tyktarmsvæv også betydeligt forbedret efter BLG-behandling. Samlet set viser disse resultater tydeligt, at BLG er effektiv til behandling af kronisk tilbagefaldende colitis hos mus.
Hvordan udøver BLG sine farmakologiske virkninger? Talrige tidligere undersøgelser har vist, at tarmmikrobiotaen spiller en nøglerolle i patogenesen af ​​UC, og mikrobiombaserede og mikrobiommålrettede terapier har vist sig at være en meget attraktiv strategi til behandling af UC. I den foreliggende undersøgelse demonstrerede vi, at BLG-behandling resulterede i signifikante ændringer i tarmmikrobiotaens sammensætning, hvilket tyder på, at den beskyttende effekt af BLG mod DSS-induceret colitis er relateret til modulering af tarmmikrobiotaen. Denne observation er i overensstemmelse med den opfattelse, at omprogrammering af tarmmikrobiotaens homeostase er en vigtig tilgang til at forstå effektiviteten af ​​TCM-præparater.36,37 Det er værd at bemærke, at Akkermansia er en gramnegativ og strengt anaerob bakterie, der lever i tarmens slimlag, som nedbryder muciner, producerer propionsyre, stimulerer bægercelledifferentiering og opretholder slimhindens barrierefunktion.26 Flere kliniske og dyredata tyder på, at Akkermansia er stærkt forbundet med sund slimhinde38 og oral administration af Akkermansia spp. kan forbedre slimhindeinflammation betydeligt.39 Vores nuværende data tyder på, at den relative forekomst af Akkermansia er signifikant forøget efter BLG-behandling. Derudover er Prevotellaceae_UCG-001 en SCFA-producerende bakterie.27 Flere undersøgelser viste, at Prevotellaceae_UCG-001 blev fundet i lav relativ forekomst i afføring fra dyr med colitis.40,41 Vores nuværende data viser også, at BLG-behandling kan øge den relative forekomst af Prevotellaceae_UCG-001 i tyktarmen hos DSS-behandlede mus signifikant. I modsætning hertil er Oscillibacter en mesofil, strengt anaerob bakterie.42 rapporterede, at den relative forekomst af Oscillibacter var signifikant forøget hos UC-mus og var signifikant positivt korreleret med IL-6- og IL-1β-niveauer og patologiske scorer.43,44 Det er værd at bemærke, at BLG-behandling signifikant reducerede den relative forekomst af Oscillibacter i afføringen hos DSS-behandlede mus. Det er værd at bemærke, at disse BLG-ændrede bakterier var de mest SCFA-producerende bakterier. Talrige tidligere undersøgelser har vist de potentielt gavnlige virkninger af SCFA'er. på koloninflammation og beskyttelse af tarmepitelets integritet.45,46 Vores nuværende data observerede også, at koncentrationerne af SCFA-acetat, propionat og butyrat i DSS-behandlet afføring var stærkt forhøjede hos BLG-behandlede mus. Samlet set viser disse fund tydeligt, at BLG-behandling effektivt kan forstærke DSS-inducerede SCFA-producerende bakterier hos mus med kronisk recidiverende colitis.
GLP-1 er et inkretin, der hovedsageligt produceres i ileum og colon, og det spiller en vigtig rolle i at forsinke mavetømning og sænke postprandial blodglukose.47 Der er tegn på, at dipeptidylpeptidase (DPP)-4, en GLP-1-receptoragonist og en GLP-1-nanomedicin effektivt kan lindre tarmbetændelse hos mus.48-51 Som rapporteret i tidligere undersøgelser var høje SCFA-koncentrationer forbundet med plasma-GLP-1-niveauer hos mennesker og mus.52 Vores nuværende data viser, at serum-GLP-1-niveauer og Gcg mRNA-ekspression var signifikant forhøjet efter BLG-behandling. Ligeledes var GLP-1-sekretion signifikant forhøjet i colonkulturer efter stimulering med fækale ekstrakter fra BLG-behandlede colitis-mus sammenlignet med stimulering med fækale ekstrakter fra DSS-behandlede colitis-mus.Hvordan påvirker SCFA'er frigivelsen af ​​GLP-1?Gwen Tolhurst et al. rapporterede, at SCFA kan stimulere GLP-1-sekretion gennem GRP43 og GPR41.29 Vores nuværende data viser også, at BLG-behandling signifikant øger mRNA-ekspressionen af ​​GRP43 og GPR41 i tyktarmen hos DSS-behandlede mus. Disse data tyder på, at BLG-behandling kan genoprette SCFA-fremmet GLP-1-produktion ved at aktivere GRP43 og GPR41.
BLG er et langtidsvirkende håndkøbslægemiddel (OTC) i Kina. Den maksimalt tolererede dosis BLG hos Kunming-mus er 80 g/kg, og der er ikke observeret akut toksicitet.53 I øjeblikket er den anbefalede dosis BLG (uden sukker) hos mennesker 9-15 g/dag (3 gange dagligt). Vores undersøgelse viste, at BLG ved 1 g/kg lindrede DSS-induceret kronisk recidiverende colitis hos mus. Denne dosis er tæt på den BLG-dosis, der anvendes klinisk. Vores undersøgelse viste også, at dets virkningsmekanisme i det mindste delvist medieres af ændringer i tarmmikrobiotaen, specifikt SCFA-producerende bakterier, såsom Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001, for at genoprette tarmafledt GLP-1-produktion. Disse fund tyder på, at BLG fortjener yderligere overvejelse som et potentielt terapeutisk middel til klinisk colitisbehandling. Den nøjagtige mekanisme, hvormed det modulerer tarmmikrobiotaen, skal dog stadig bekræftes af mikrobiota-deficiente mus og fækal bakterietransplantation.
Es, eddikesyre; men, smørsyre; BLG, pandan; DSS, dextran-natriumsulfat; DAI, sygdomsaktivitetsindeks; DPP, dipeptidylpeptidase; FID, flammeioniseringsdetektor; F-Con, kontrol Fækalekstrakter fra mus; F-DSS, fækalekstrakter fra DSS-colitis-mus; F-BLG, fækalekstrakter fra BLG-behandlede colitis-mus; GLP-1, glukagonlignende peptid-1; Gcg, glukagon; gaskromatografi, gaskromatografi; GRP43, G-proteinkoblet receptor 43; GRP41, G-proteinkoblet receptor 41; H&E, hæmatoxylin-eosin; HBSS, Hanks' balancerede saltopløsning; OTC, OTC; PCA, principal component analysis; PCoA, principal coordinate analysis; Pro, propionsyre; SASP, sulfasalazin; SCFA, kortkædede fedtsyrer; kinesisk medicin, traditionel kinesisk medicin; UC, ulcerøs colitis.
Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af den dyreetiske komité ved Peking University Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, Kina) i henhold til de institutionelle retningslinjer og dyreforskrifterne (etiknummer A2020157).
Alle forfattere ydede væsentlige bidrag til koncept og design, dataindsamling eller dataanalyse og -fortolkning; deltog i udarbejdelsen af ​​artiklen eller kritisk revision af vigtigt intellektuelt indhold; indvilligede i at indsende manuskriptet til det aktuelle tidsskrift; godkendte endeligt versionen til offentliggørelse; var ansvarlige for alle aspekter af arbejdet.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81560676 og 81660479), det førsteklasses projekt fra Shenzhen University (86000000210), Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026) og Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 og A2020272), Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province finansieret af Key Laboratory (YWZJ2020-01) og Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Triptolids terapeutiske potentiale som et antiinflammatorisk middel ved dextran-natriumsulfat-induceret eksperimentel colitis hos mus. præ-immun. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Den globale byrde af IBD: fra 2015 til 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue m.fl. Planteafledte alkaloider: lovende sygdomsmodifikatorer i inflammatorisk tarmsygdom. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B m.fl. Indigo Naturalis hæmmer oxidativt stress i tyktarmen og Th1/Th17-responser i DSS-induceret colitis hos mus. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Effektivitet og sikkerhed af Sophora flavescens (Sophora flavescens) kinesisk urtemedicin i behandlingen af ​​colitis ulcerosa: klinisk evidens og potentielle mekanismer. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Naturprodukter: eksperimentelt effektive lægemidler til behandling af inflammatorisk tarmsygdom. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Refleksioner over adjuverende behandling af colitis ulcerosa med traditionel kinesisk medicin. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT m.fl. Effektivitet og sikkerhed af Banlangen-granulat i behandlingen af ​​sæsoninfluenza: en studieprotokol for et randomiseret kontrolleret forsøg. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x