Proteinsortering i den sekretoriske vej er essentiel for at opretholde cellekompartmentalisering og homeostase. Ud over skalmedieret sortering er lipiders rolle i kinesinsortering i processen med sekretorisk transport et længe eksisterende grundlæggende spørgsmål, der endnu ikke er blevet besvaret. Her udfører vi 3D simultan flerfarvet højopløsnings realtidsbilleddannelse for at bevise in vivo, at nyligt syntetiserede glycosylphosphatidylinositol-immobiliserede proteiner med meget lange ceramidlipiddele er grupperet og klassificeret i specialiserede endoplasmaer Net exit site, hvilket er forskelligt fra det, der anvendes af transmembrane proteiner. Derudover viser vi, at ceramids kædelængde i det endoplasmatiske retikulummembran er kritisk for denne sorteringsselektivitet. Vores undersøgelse giver det første direkte in vivo-bevis for at klassificere proteinlaster baseret på lipidkædelængde i selektive eksportsteder i den sekretoriske vej.
I eukaryote celler sorteres de proteiner, der syntetiseres i det endoplasmatiske reticulum (ER), derefter under transport gennem den sekretoriske vej for levering til deres passende cellulære destination (1). Ud over coat-medieret sortering har det længe været spekuleret i, at visse lipider også kan tjene som selektive udgangspunkter ved at gruppere dem i specifikke membrandomæner, der specifikt omhandler proteiner (2-5). Der mangler dog stadig direkte in vivo-beviser til at bevise denne mulige lipidbaserede mekanisme. For at løse dette grundlæggende problem undersøgte vi i gær, hvordan glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankrede proteiner (GPI-AP'er) eksporteres differentielt fra ER. GPI-AP'er er en række lipidforbundne celleoverfladeproteiner (6, 7). GPI-AP er et udskilt protein, der er bundet til de ydre småblade af plasmamembranen gennem glycolipiddelen (GPI-anker). De accepterer GPI-ankre som konservative posttranslationelle modifikationer i ER-lumen (8). Efter binding passerer GPI-AP gennem Golgi-apparatet (5, 9) fra ER til plasmamembranen. Tilstedeværelsen af ​​GPI-ankre forårsager, at GPI-AP transporteres separat fra transmembrane secernerede proteiner (inklusive andre plasmamembranproteiner) langs den sekretoriske vej (5, 9, 10). I gærceller separeres GPI-AP'er fra andre secernerede proteiner i det endoplasmatiske reticulum og pakkes derefter i unikke vesikler omsluttet af kappeproteinkompleks II (COPII) (6, 7). Determinanterne for denne klassificeringsproces i ER-eksportprocessen er uklare, men det spekuleres i, at denne mekanisme kan kræve lipider, især den strukturelle ombygning af lipiddelen af ​​GPI-ankeret (5, 8). I gær begynder GPI-lipidombygning umiddelbart efter, at GPI binder sig, og i mange tilfælde forårsager det, at ceramid binder sig til den 26-kulstofatom lange mættede fedtsyre (C26:0) (11, 12). C26-ceramid er det ceramid, der indtil videre primært produceres af gærceller. Det syntetiseres i ER, og det meste eksporteres til Golgi-apparatet gennem COPII-vesikler (13). ER-eksporten af ​​GPI-AP kræver specifikt løbende ceramidsyntese (14, 15), og omdannelsen af ​​ceramid til inositolfosfatceramid (IPC) i Golgi-apparatet afhænger til gengæld af GPI-ankersyntese (16). Biofysiske undersøgelser med kunstige membraner har vist, at meget lange acylkædeceramider kan smelte sammen og danne ordnede domæner med unikke fysiske egenskaber (17, 18). Disse data fører til hypotesen om, at C26-ceramid og GPI-AP med C26-ceramid bruger deres fysiske egenskaber til at smelte sammen til ordnede områder eller regioner i det relativt rodede ER-membranlipidmiljø. Det består hovedsageligt af korte og umættede glycerolipider (C16:1 og C18:1) (19, 20). Disse regioner vil blive selektivt fokuseret på specifikke ER-udgangssteder (ERES), hvor ceramid og ceramidbaseret GPI-AP kan transporteres sammen til Golgi-området i den samme dedikerede COPII-vesikel (5).
I dette studie har vi direkte testet denne lipidbaserede mekanisme ved hjælp af superopløsningskonfokal realtidsbilleddannelsesmikroskopi (SCLIM), som er en banebrydende mikroskopiteknik, der samtidigt kan observere fluorescensmærkede proteiner. De trefarvede og tredimensionelle (3D) billeder har ekstremt høj opløsning og hastighed i levende celler (21, 22).
Vi anvendte først SCLIM-teknologi til yderligere at definere, hvordan normal GPI-AP med C26-ceramidgruppen blev screenet fra transmembransecernerede proteiner efter at have forladt ER i S. cerevisiae. For at kontrollere klassificeringen af ​​ER anvendte vi et genetisk system, der direkte kan visualisere nyligt syntetiseret last, der kommer ind i ERES in vivo (7, 23). Som last valgte vi C26-ceramidbaseret GPI-AP Gas1 mærket med grønt fluorescerende protein (GFP) og transmembransecerneret protein Mid2 mærket med nær-infrarødt fluorescerende protein (iRFP), som begge er rettet mod plasmamembranen (24-26). I den temperaturfølsomme mutant sec31-1 udtrykkes disse to laster under en galactose-inducerbar promotor og en konstitutiv ERES-markør. Ved den ekstreme temperatur (37°C), fordi sec31-1-mutationen påvirker funktionen af ​​COPII-coatkomponenten Sec31 til at hæmme COPII-spiring og ER-eksport, akkumuleres nyligt syntetiseret last ved ER (23). Efter afkøling til en lav temperatur (24°C) kom sec31-1-mutantcellerne sig fra det sekretoriske område, og den akkumulerede nye syntetiske last begyndte at blive eksporteret fra ER. CLIM-visualisering viste, at det meste af det nyligt syntetiserede Gas1-GFP og Mid2-iRFP stadig akkumulerede sig i ER af sec31-1-mutantcellerne efter inkubation ved 37°C og derefter frigivet ved 24°C i 5 minutter (Figur 1). Da Mid2-iRFP er fordelt på hele ER-membranen, og Gas1-GFP er koncentreret og samlet i det diskontinuerlige ER-membranområde, er deres fordeling helt anderledes (Figur 1, A til C og Film S1). Derudover, som vist i Figur 1D, har Gas1-GFP-klyngen ikke Mid2-iRFP. Disse resultater indikerer, at GPI-AP og transmembranproteiner blev separeret i forskellige ER-membranregioner tidligt. Gas1-GFP-klyngen støder op til en specifik ERES mærket med mCherrys COPII-kappeprotein Sec13 (Figur 1, E og F, og film S1) (23).
sec31-1-celler udtrykker galactose-inducerede sekreter, et lang acylkædet (C26) ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grøn) og transmembranproteinet Mid2-iRFP (TMP, blå), og denne konstruktive ERES-mærkning Sec13-mCherry (ERES, magenta) blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter, flyttet til 24°C og afbildet af SCLIM 5 minutter senere. (A til C) viser et repræsentativt flettet eller enkelt 2D-billede af et plan (A), et 2D-projektionsbillede af 10 z-sektioner (B) eller et 3D-cellehemisfærebillede af cargo og ERES-markører (C). Målestok 1μm (A og B). Skalaenheden er 0,551μm (C). Gas1-GFP blev detekteret i diskrete ER-regioner eller klynger, mens Mid2-iRFP blev detekteret og fordelt i hele ER-membranen (C). (D) Grafen viser den relative fluorescensintensitet af Gas1-GFP og Mid2-iRFP i Gas1-GFP-klyngen langs den hvide pilelinje (venstre). AU, vilkårlig enhed. (E og F) repræsenterer 3D-billedet, der kombinerer varerne og ERES-mærket. Gas1-GFP-klynger blev detekteret nær den specifikke ERES. Skalaenheden er 0,551 μm. (F) Den hvide, solide pil markerer Gas1-GFP-klyngen, der er forbundet med ERES. De midterste og højre paneler viser det fusionerede, forstørrede 3D-billede og en roteret visning af den valgte Gas1-GFP-klynge.
Det tætte rumlige forhold mellem Gas1-GFP-klyngen og en specifik ERES indikerer, at Gas1-GFP kan trænge ind i selektiv ERES, hvilket er forskelligt fra den selektivitet, som Mid2-iRFP bruger til at forlade ER. For at imødegå denne mulighed kvantificerede vi ERES-forholdet for kun én eller to varer (Figur 2, A til C). Vi fandt, at de fleste ERES (70%) kun indeholder én type last. Det nederste billede i Figur 2C viser to typiske eksempler på ERES med kun Gas1-GFP (Figur 1) eller kun Mid2-iRFP (Figur 2). I modsætning hertil indeholder cirka 20% af ERES to laster, der overlapper hinanden i samme område. Det blev fundet, at nogle ERES (10%) indeholdt to typer last, men de var isoleret i tydeligt forskellige områder. Derfor viser denne statistiske analyse, at efter at ER er eksporteret, er GPI-AP Gas1-GFP og den transmembrane last Mid2-iRFP opdelt i forskellige ERES (Figur 2D). Denne sorteringseffektivitet er meget i overensstemmelse med den tidligere biokemiske analyse (6) og morfologiske bestemmelse (7). Vi kan også observere opførslen af ​​den karantænefragt, der kommer ind i ERES (Figur 2E og Film S2). Figur 2E viser, at kun en lille del af Gas1-GFP (panel 3) eller Mid2-iRFP (panel 4) kommer ind i ERES fra den ene side og er indespærret i et separat område. Panel 5 i Figur 2E viser, at Gas1-GFP og Mid2-iRFP nogle gange findes i den samme ERES, men de kommer ind fra forskellige sider og er koncentreret i separate regioner, der kan repræsentere forskellige COPII-vesikler. Vi bekræftede også, at den observerede separation og klassificering af C26-ceramidbaseret GPI-AP Gas1 som selektiv ERES er specifik, fordi en anden transmembran sekretionsfragt, det GFP-mærkede plasmamembranprotein Axl2 (27), viser lignende opførsel som Mid2-iRFP. (Billede S1 og Film S3). Det nyligt syntetiserede Axl2-GFP distribueres gennem ER-membranen ligesom Mid2-iRFP (Figur S1, A og B) og er ko-lokaliseret med Mid2-iRFP i de fleste ERES (Figur S1, B til D). Panel 1 og 2 i Figur 1. S1C viser to typiske eksempler på ERES, hvor to transmembrane laster overlapper hinanden. I disse tilfælde kommer begge varer ind i ERES sammen (Figur S1E, Panel 3 og Film S3).
De sec31-1-celler, der udtrykker galactose-inducerbare sekreter, Gas1-GFP (GPI-AP, grøn) og Mid2-iRFP (TMP, blå) og konstitutiv ERES-mærkning Sec13-mCherry (ERES, magenta), blev placeret ved 37 °C. Efter inkubation i 30 minutter ved °C, flyt til 24 °C for at frigive sekretionsblokken, og afbild med SCLIM efter 20 minutter. (A til C) Repræsentative 2D-projektionsbilleder (A; skalalinje, 1 μm) eller 3D-cellehemisfærebilleder (B og C; skalaenhed, 0,456 μm) af lasten og 10 z-sektioner markeret med ERES. Det nederste panel i (B) og panelet i (C) viser behandlede billeder for kun at vise de varer, der er til stede i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) og Mid2-iRFP (lyseblå)]. (C) Åben pil: ERES transporterer kun ét stykke last (1 til 4). Grå pil: ERES indeholder adskilt last (5). Hvid, solid pil: ERES indeholder samlokaliseret last. Nedenfor: Den valgte enkeltstående ERES indeholder kun Gas1-GFP (1) eller Mid2-iRFP (2). Målestok, 100 nm. (D) Kvantificering af fotomikrografen beskrevet i (C). Den gennemsnitlige procentdel af ERES, der kun indeholder én last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP), adskilt last og overlappende last. I tre uafhængige eksperimenter, n = 432 i 54 celler. Fejlsøjle = SD. Tosidet uparret t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-billede af udvalgt ERES af karantænelast markeret med (C). Gas1-GFP (grøn) (3) eller Mid2-iRFP (blå) (4) kommer ind i ERES (magenta) fra den ene side og er begrænset til et lille område inden for ERES. Nogle gange kommer begge typer last ind i den samme ERES (5) fra den samme side og er begrænset til et isoleret område inden for ERES. Skalalinje, 100 nm.
Dernæst testede vi en hypotese om, at den lange acylkædede ceramid (C26), der er til stede i ER-membranen, driver den specifikke gruppering og sortering af Gas1 til selektiv ERES. Til dette formål anvendte vi en modificeret gærstamme GhLag1, hvor de to endogene ceramidsyntaser Lag1 og Lac1 blev erstattet af GhLag1 (Lag1-homologen af ​​bomuld), hvilket resulterede i en gærstamme med en cellemembran-ceramidstamme, der er kortere end vildtypen (Figur 3A) (28). Massespektrometri (MS)-analyse viste, at i vildtypestammer er 95 % af det samlede ceramid meget langkædet (C26) ceramid, mens i GhLag1 er 85 % af ceramidet meget langkædet (C18 og C16), kun 2 % af ceramidet er meget langkædet (C26) ceramid. Selvom C18- og C16-ceramider er de primære ceramider, der indtil videre er detekteret i GhLag1-membranen, bekræftede MS-analyse også, at GPI-ankeret i Gas1-GFP udtrykt i GhLag1-stammen indeholder C26-ceramid, hvilket kan sammenlignes med vildtypelipider. Kvaliteten er den samme (fig. 3A) (26). Det betyder derfor, at ceramid-remodelleringsenzymet Cwh43 er yderst selektivt for C26-ceramid, som vist i figur 26, og det inkorporerer fortrinsvis GPI-ankeret fra en lille mængde C26-ceramid i GhLag1-stammen. S2 (29). Ikke desto mindre indeholder cellemembranen i GhLag1 grundlæggende kun C18-C16-ceramid, mens Gas1-GFP stadig indeholder C26-ceramid. Denne kendsgerning gør denne stamme til et ideelt værktøj til specifikt at løse problemet med acylkædelængden af ​​membranceramid i ER. Den hypotetiske rolle af klasse og sortering. Derefter undersøgte vi først C26 Gas1-GFP's evne til at akkumulere i klynger i GhLag1 med en temperaturfølsom mutantallel af sec31-1 gennem konventionel fluorescensmikroskopi, hvor kun den lange (C18-C16) kæde findes i ER-membranens ceramid (fig. 3). Vi observerede, at i sec31-1 var det meste af Gas1-GFP koncentreret i klynger, mens Gas1-GFP i sec31-1 GhLag1 med lang (C18-C16) lang ceramid-ER-membran hovedsageligt ikke var klynget og fordelt i hele ER-membranen. For at være præcis, fordi C26-ceramidbaseret klyngedannelse er tæt forbundet med specifik ERES (figur 1), undersøgte vi derefter, om denne proces også kan involvere funktionen af ​​ER-eksportproteinmekanismen. GPI-AP bruger et specielt COPII-system til ER-eksport, som aktivt reguleres af Ted1's strukturelle ombygning af glykandelen af ​​GPI-ankeret (30, 31). Den rekombinante GPI-glykan genkendes derefter af det transmembrane cargoreceptor p24-kompleks, som igen selektivt rekrutterer Lst1, som er en specifik isoform af den primære COPII-cargobindingsunderenhed Sec24, hvilket danner en GPI-AP-rig COPII. Vesikler er nødvendige (31-33). Derfor konstruerede vi en dobbeltmutant, der kombinerede deletionen af ​​disse enkeltproteiner (p24-komplekskomponenten Emp24, GPI-glykan-remodelleringsenzym Ted1 og den specifikke COPII-underenhed Lst1) med sec31-1-mutantstammen og undersøgte, om det er muligt at danne Gas1-klynge-GFP (Figur 3). Vi observerede, at i sec31-1emp24Δ og sec31-1ted1Δ er Gas1-GFP hovedsageligt ikke-klynget og fordelt i hele ER-membranen, som tidligere set i sec31-1 GhLag1, mens i sec31-1lst1Δ er Gas1-GFP ligesom sec31-1. Disse resultater indikerer, at udover tilstedeværelsen af ​​C26-ceramid i ER-membranen, skal clustering af Gas1-GFP også binde til p24-komplekset og ikke kræver specifik Lst1-rekruttering. Derefter undersøgte vi muligheden for, at ceramidkædelængden i ER-membranen kan regulere bindingen af ​​Gas1-GFP til p24. Vi fandt imidlertid, at tilstedeværelsen af ​​C18-C16-ceramid i membranen ikke påvirker de GPI-glykaner, der rekonstrueres af p24-komplekset (figur S3 og S4, A og B) eller bindingen til GPI-AP og eksportevnen af ​​GPI-AP. Rekrutter COPII-subtype Lst1 (figur S4C). Derfor kræver C26-ceramidafhængig clustering ikke proteininteraktioner med forskellige ER-eksportproteinmekanismer, men understøtter en alternativ sorteringsmekanisme drevet af lipidlængde. Derefter analyserede vi, om ceramidacylkædelængden i ER-membranen er vigtig for den effektive klassificering af Gas1-GFP som selektiv ERES. Da Gas1 i GhLag1-stammen med kortkædet ceramid forlader ER og kommer ind i plasmamembranen (Figur S5), mener vi, at hvis sorteringen er drevet af længden af ​​ceramidacylkæden, kan Gas1 i GhLag1-stammen omdirigeres og krydses. ERES-varer med den samme membran.
(A) Cellemembranen i GhLag1 indeholder hovedsageligt kortere C18-C16 ceramider, mens GPI-ankeret i Gas1-GFP stadig har den samme C26 IPC som vildtypeceller. Ovenfor: Acylkædelængdeanalyse af ceramid i cellemembranen i vildtype (Wt) og GhLag1p-stammer ved massespektrometri (MS). Dataene repræsenterer procentdelen af ​​total ceramid. Gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter. Fejllinje = SD. Tosidet uparret t-test. **** P <0,0001. Nederste panel: MS-analyse af acylkædelængden af ​​den IPC, der er til stede i Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-ankeret udtrykt i vildtype- og GhLag1p-stammerne. Dataene repræsenterer procentdelen af ​​det samlede IPC-signal. Gennemsnit af fem uafhængige eksperimenter. Fejllinje = SD. Tosidet uparret t-test. ns, ikke vigtig. P = 0,9134. (B) Fluorescensmikrografer af sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ og sec31-1lst1Δ celler, der udtrykker galactose-induceret Gas1-GFP, blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter og sendt videre til 24°C. Udfør rutinemæssig fluorescensmikroskopi efter 24°C. Hvid pil: ER Gas1-GFP klynge. Åben pil: Ikke-klynget Gas1-GFP er fordelt på hele ER-membranen og viser den karakteristiske ER-kerneringfarvning. Målestok, 5 μm. (C) Kvantificering af fotomikrografen beskrevet i (B). Den gennemsnitlige procentdel af celler med punktformet Gas1-GFP-struktur. I tre uafhængige eksperimenter, n≥300 celler. Fejllinje = SD. Tosidet uparret t-test. **** P <0,0001.
For direkte at løse dette problem udførte vi SCLIM-visualisering af Gas1-GFP og Mid2-iRFP i GhLag1 med den temperaturfølsomme mutantallel sec31-1 (Figur 4 og Film S4). Efter at ER blev bevaret ved 37°C og efterfølgende frigivet ved 24°C, var det meste af den nyligt syntetiserede Gas1-GFP ikke klynget og fordelt i hele ER-membranen, som observeret af konventionelle mikroskoper (Figur 4, A og B). Derudover inkluderer en stor procentdel af ERES (67%) to typer last, der er placeret sammen i den (Figur 4D). Panel 1 og 2 i Figur 4C viser to typiske eksempler på ERES med overlappende Gas1-GFP og Mid2-GFP. Derudover blev begge varer rekrutteret til den samme ERES (Figur 4E, panel 3 og Film S4). Derfor indikerer vores resultater, at længden af ​​ceramidacylkæden i ER-membranen er en vigtig determinant for ER-proteinaggregering og -klassificering.
Sec31-1 GhLag1-celler, der udtrykker galaktose-inducerede sekreter, Gas1-GFP (GPI-AP, grøn) og Mid2-iRFP (TMP, blå) og konstitutiv ERES-mærket Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkuber ved 37°C. Fortsæt i 30 minutter, sænk temperaturen til 24°C for at frigive sekreter, og afbild med SCLIM efter 20 minutter. (A til C) Repræsentative 2D-projektionsbilleder (A; skalalinje, 1μm) eller 3D-cellehemisfærebilleder (B og C; skalaenhed, 0,45μm) af de 10 z-sektioner markeret med cargo og ERES. Det nederste panel i (B) og panelet i (C) viser behandlede billeder for kun at vise de varer, der er til stede i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) og Mid2-iRFP (lyseblå)]. (C) Hvid udfyldt pil: ERES, varer overlapper hinanden. Åben pil: ERES indeholder kun ét element. Nederste panel: Den valgte ERES har overlappende varer (1 og 2) markeret i (C). Målestok, 100 nm. (D) Kvantificering af fotomikrografen beskrevet i (C). I sec31-1 og sec31-1 GhLag1 enhederne er kun én last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP) inkluderet, og den gennemsnitlige procentdel af ERES for isoleret last og overlappende last. I tre uafhængige eksperimenter, n = 432 i 54 celler (sec31-1) og n = 430 i 47 celler (sec31-1 GhLag1). Fejlstang = SD. Tosidet uparret t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) og ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-billede af udvalgt ERES med overlappende last (3) markeret i (C). Gas1-GFP (grøn) og Mid2-iRFP (blå) nærmer sig ERES (magenta) fra samme side og forbliver i det samme ERES-begrænsede område. Målestok, 100 nm.
Denne undersøgelse giver direkte in vivo bevis for, at lipidbaserede proteinladninger klassificeres i selektive eksportsteder i den sekretoriske vej, og afslører vigtigheden af ​​acylkædelængde for klassificeringsselektivitet. Ved hjælp af en kraftfuld og banebrydende mikroskopiteknik kaldet SCLIM demonstrerede vi det nyligt syntetiserede Gas1-GFP (en vigtig plasmamembran GPI-AP med en meget lang acylkæde (C26) ceramidlipiddel) i gær). Regionerne grupperet i diskrete ER'er er forbundet med specifikke ERES, mens transmembransecernerede proteiner er fordelt i hele ER-membranen (Figur 1). Derudover kommer disse to typer varer selektivt ind i forskellige ERES'er (Figur 2). Acylkædelængden af ​​det cellulære ceramid i membranen reduceres fra C26 til C18-C16, Gas1-GFP-klyngen afbrydes til den diskrete ER-region, og Gas1-GFP omdirigeres for at forlade ER med transmembranproteinet gennem den samme ERES (Figur 3 og Figur 3).4).
Selvom GPI-AP bruger en specialiseret proteinmekanisme til at forlade ER, fandt vi, at C26-ceramidafhængig separation ikke er afhængig af differentielle proteininteraktioner, der kan føre til ERES-specialisering (figur S4 og S5). I stedet understøtter vores resultater en alternativ klassificeringsmekanisme drevet af lipidbaseret proteinklyngedannelse og efterfølgende udelukkelse af andre laster. Vores observationer indikerer, at Gas1-GFP-regionen eller -klyngen associeret med en specifik ERES mangler det transmembrane secernerede protein Mid2-iRFP, hvilket indikerer, at den C26-ceramidafhængige GPI-AP-klynge vil lette deres adgang til den relevante ERES og samtidig udelukke transmembrane sekreter. Sekreterne trænger ind i denne specifikke ERES (figur 1 og 2). I modsætning hertil forårsager tilstedeværelsen af ​​C18-C16-ceramider i ER-membranen ikke, at GPI-AP danner regioner eller klynger, så de udelukker eller erstatter ikke transmembrane secernerede proteiner i den samme ERES (figur 3 og 4). Derfor foreslår vi, at C26-ceramid driver separation og klassificering ved at fremme klyngning af proteiner knyttet til specifikke ERES.
Hvordan opnår man denne C26-ceramidafhængige klyngedannelse i et specifikt ER-område? Membranceramiders tendens til at separere lateralt kan forårsage, at GPI-AP og C26-ceramid danner små og øjeblikkeligt ordnede lipider i det mere uregelmæssige lipidmiljø i ER-membranen, der indeholder kortere og umættede glycerolipider. Kvalitetsklynger (17, 18). Disse små midlertidige klynger kan yderligere fusioneres til større, mere stabile klynger efter binding til p24-komplekset (34). I overensstemmelse med dette viste vi, at C26 Gas1-GFP skal interagere med p24-komplekset for at danne større synlige klynger (Figur 3). P24-komplekset er en heterozygot oligomer sammensat af fire forskellige p24-transmembranproteiner i gær (35), hvilket giver multivalent binding, hvilket kan føre til tværbinding af små GPI-AP-klynger og derved generere større stabile klynger (34). Interaktionen mellem protein-ectodomænerne i GPI-AP'er kan også bidrage til deres aggregering, som vist under deres Golgi-transport i pattedyrs polariserede epitelceller (36). Når C18-C16 ceramid er til stede i ER-membranen, vil der imidlertid ikke dannes store separate klynger, når p24-komplekset binder til Gas1-GFP. Den underliggende mekanisme kan afhænge af de specifikke fysiske og kemiske egenskaber ved den lange acylkædede ceramid. Biofysiske undersøgelser af kunstige membraner viser, at selvom både lange (C24) og korte (C18-C16) acylkædede ceramider kan forårsage faseseparation, er det kun lange acylkædede ceramider (C24), der kan fremme høj krumning og filmbøjning for at omforme filmen. Gennem gensidig reference (17, 37, 38). Det er blevet vist, at den transmembrane helix af TMED2, den humane homolog af Emp24, selektivt interagerer med C18 ceramid-baseret sphingomyelin i de cytoplasmatiske lobuler (39). Ved hjælp af molekylærdynamiske (MD) simuleringer fandt vi, at både C18 og C26 ceramider akkumuleres omkring de cytoplasmatiske lobuler i Emp24 transmembrane helix, og de har lignende præferencer (Figur S6). Det er værd at bemærke, at dette indikerer, at den transmembrane helix af Emp24 kan føre til asymmetrisk fordeling af lipider i membranen. Dette er et nyligt resultat baseret på pattedyrceller. Lignende MD-simuleringer viser også tilstedeværelsen af ​​etherlipider (40). Derfor spekulerer vi i, at C26 ceramid i de to lobuler af ER26 er lokalt beriget. Når GPI-AP i de luminale lobuler binder sig direkte til multivalent p24 og akkumulering af C26-ceramid omkring p24 i de cytoplasmatiske lobuler, kan det fremme den ledsagende proteinaggregering, og membrankrumning genereres gennem fingrene (41), hvilket får GPI-AP til at separere i diskrete regioner ved siden af ​​ERES, hvilket også favoriserer de stærkt krumme regioner af ER-membranen (42). Tidligere rapporter understøttede den foreslåede mekanisme (43, 44). Den multivalente binding af oligolectiner, patogener eller antistoffer til ceramidbaserede glycosphingolipider (GSL) på plasmamembranen udløser stor GSL-aggregering, forstærker faseseparation og forårsager membrandeformation og internalisering (44). Iwabuchi etc. (43) Det blev fundet, at i nærvær af lange (C24), men ikke korte (C16) acylkæder, inducerede den multivalente ligand bundet til GSL-lactosylceramid dannelsen af ​​store klynger og membraninvagination, og den cytoplasmatiske Lyn-medierede signaltransduktion på småbladene er interdigiteret af acylkæder i koblede neutrofiler.
I pattedyrs polariserede epitelceller styrer koncentrationen af ​​anti-Golgi-netværket (TGN) til niveauet af den apikale plasmamembran separationen og sorteringen af ​​GPI-AP (10, 45). Denne aggregering er drevet af GPI-AP-oligomerisering (36), men den kan også afhænge af ceramidkædelængden, som vi finder i gær. Selvom pattedyrs GPI-AP har et etherlipidbaseret anker, og dets kemiske struktur er meget forskellig fra det meget lange acylkædede ceramid, viste en nylig undersøgelse, at begge lipider har evolutionært lignende fysiske og kemiske egenskaber og funktion (40). Derfor kan etherlipiddelen i pattedyrsceller ligne C26-ceramidet i gær, og dets rolle er at associere med det langkædede ceramid i membranen for at fremme GPI-AP-aggregering og sortering. Selvom denne mulighed stadig skal testes direkte, understøtter tidligere fund, at transporten af ​​det langkædede acylkædede ceramid til Golgi-legemet ikke udføres af cytoplasmatiske transferproteiner, men afhænger af syntesen af ​​GPI-ankre som gær. Derfor synes den evolutionære konservative mekanisme at være i stand til selektivt at co-transportere meget lang acylkædeceramid og GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) i den samme transportvesikel.
I gær- og pattedyrs polariserede epitelcellesystemer forekommer GPI-AP-aggregering og separation fra andre plasmamembranproteiner, før de når celleoverfladen. Paladino et al. (48) fandt, at på TGN af pattedyrs polariserede epitelceller er GPI-AP-klyngedannelse ikke kun nødvendig for den selektive klassificering af GPI-AP'er til den apikale plasmamembran, men regulerer også klyngedannelsesorganisationen af ​​GPI-AP'er og dens biologiske aktivitet. Celleoverflade. I gær viste denne undersøgelse, at den C26-ceramidafhængige GPI-AP-klynge på ER kan regulere klyngeorganisationen og den funktionelle aktivitet af GPI-AP på plasmamembranen (24, 49). I overensstemmelse med denne model er GhLag1-celler allergiske over for GPI-hæmmere eller lægemidler, der påvirker cellevæggens integritet (28), og behovet for funktionelle Gas1-GFP-klynger (49) af tipceramidet, der projiceres i parringen af ​​gærceller, indikerer G​​​ Mulige fysiologiske konsekvenser af hLag1-celler. GPI-AP-fejl. Yderligere test af, om celleoverfladens funktionelle organisering er blevet programmeret fra ER ved en sorteringsmetode baseret på lipidlængde, vil dog være genstand for vores fremtidige forskning.
De Saccharomyces cerevisiae-stammer, der blev anvendt i dette arbejde, er anført i tabel S1. MMY1583- og MMY1635-stammerne af SCLIM til levende cellebilleddannelse blev konstrueret i baggrunden af ​​W303. Disse stammer, der udtrykker Sec13-mCherry med et fluorescerende proteinmærke, blev konstrueret ved hjælp af en polymerasekædereaktions (PCR)-baseret metode med pFA6a-plasmid som skabelon (23). Stammen, der udtrykker Mid2-iRFP mærket med fluorescerende protein under kontrol af GAL1-promotoren, blev konstrueret som følger. PCR-amplifikation af iRFP-KanMx-sekvens fra pKTiRFP-KAN-vektor (gave fra E. O'Shea, Addgene-plasmidnummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; forskningsressourceidentifikator (RRID): Addgene_64687) og indsat i C-terminalen af ​​endogen Mid2. Efter at Mid2-iRFP-genomsekvensen var blevet amplificeret og klonet ind i GAL1-promotoren, blev den integreret i Not I-Sac I-stedet i integrationsplasmidet pRS306. Det resulterende plasmid pRGS7 blev lineariseret med Pst I for at integrere i URA3-locuset.
Gas1-GFP-fusionsgenet udtrykkes under kontrol af GAL1-promotoren i centromer (CEN)-plasmidet, som er konstrueret som følger. Gas1-GFP-sekvensen blev amplificeret ved PCR fra pRS416-GAS1-GFP-plasmidet (24) (gave fra L. Popolo) og klonet ind i Xma I-Xho I-stedet i CEN-plasmidet pBEVY-GL LEU2 (gave fra C). Miller; Addgene-plasmidnummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Det resulterende plasmid blev navngivet pRGS6. Axl2-GFP-fusionsgenet udtrykkes også under kontrol af GAL1-promotoren i pBEVY-GL LEU2-vektoren, og dets konstruktion er som følger. Axl2-GFP-sekvensen blev amplificeret fra pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmidet (23) ved PCR og klonet ind i BamHI-PstI-stedet i pBEVY-GL LEU2-vektoren. Det resulterende plasmid blev navngivet pRGS12. Sekvensen af ​​de oligonukleotider, der blev anvendt i dette studie, er anført i tabel S2.
Stammen blev suppleret med 0,2% adenin og 2% glukose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose]-rigt gærekstraktprotein p (YP)-medium (1% gærekstrakt og 2% protein ept. (YPR)] eller 2% galactose [YP-galactose (YPG)] som kulstofkilde eller i et syntetisk minimalt medium (0,15% gærnitrogenbase og 0,5% ammoniumsulfat) for at supplere passende aminosyrer og baser, der kræves til ernæring, og indeholdende 2% glukose (syntetisk glukoseminimalmedium) eller 2% galactose (syntetisk galactoseminimalmedium) som kulstofkilde.
Til realtidsbilleddannelse blev temperaturfølsomme sec31-1-mutantceller, der udtrykte konstruktionen under GAL1-promotoren, dyrket i YPR-medium ved 24 °C natten over til midt-logaritmisk fase. Efter induktion i YPG ved 24 °C i 1 time blev cellerne inkuberet i SG ved 37 °C i 30 minutter og derefter overført til 24 °C for at frigøre sig fra sekretionsblokken. Concanavalin A blev brugt til at fiksere cellerne på et objektglas og afbildet med SCLIM. SCLIM er en kombination af Olympus IX-71 inverteret fluorescensmikroskop og UPlanSApo 100×1.4 numerisk apertur olielinse (Olympus), højhastigheds og højt signal-støj-forhold roterende disk konfokal scanner (Yokogawa Electric), specialfremstillet spektrometer og specialfremstillet køling. Systemets billedforstærker (Hamamatsu Photonics) kan give et forstørrelseslinsesystem med en endelig forstørrelse på ×266.7 og et ladningskoblet enhedskamera, der multiplicerer elektroner (Hamamatsu Photonics) (21). Billedoptagelse udføres af specialfremstillet software (Yokogawa Electric). Til 3D-billeder brugte vi en specialfremstillet piezoelektrisk aktuator til at vibrere objektivlinsen lodret og samlede de optiske dele 100 nm fra hinanden i en stak. Z-stacken konverteres til 3D voxeldata, og den teoretiske punktspredningsfunktion, der bruges til det roterende disk konfokale mikroskop, bruges til dekonvolutionsbehandling af Volocity-software (PerkinElmer). ERES inklusive last blev målt ved hjælp af Volocity-software til automatisk tærskelværdi for samlokaliseringsanalyse. Linjescananalyse blev udført ved hjælp af MetaMorph-software (Molecular Devices).
Brug GraphPad Prism-softwaren til at bestemme statistisk signifikans. For den tosidede Student's t-test og den almindelige envejs variansanalyse (ANOVA)-test anses forskelle mellem grupper for at have en signifikant indflydelse på P <0,05 (*).
Til fluorescensmikroskopi af Gas1-GFP blev logaritmiske faseceller dyrket natten over i YPD og opsamlet ved centrifugering, vasket to gange med fosfatbufret saltvand og inkuberet på is i mindst 15 minutter og derefter undersøgt under mikroskopet som tidligere beskrevet i tjek (24). Leica DMi8-mikroskopet (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) udstyret med en objektivlinse, L5 (GFP) filter, Hamamatsu-kamera og Application Suite X (LAS X) software blev anvendt til optagelse.
Prøverne blev denatureret med SDS-prøvebuffer ved 65 °C i 10 minutter og derefter separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Til immunoblotting-analyse blev 10 μl prøve påført pr. bane. Primært antistof: Brug polyklonalt kanin-anti-Gas1 i en fortynding på 1:3000, polyklonalt kanin-anti-Emp24 i en fortynding på 1:500 og polyklonalt kanin-anti-GFP (en gave fra H. Riezman) i en fortynding på 1:3000. Det monoklonale mus-anti-Pgk1-antistof blev anvendt i en fortynding på 1:5000 (en gave fra J. de la Cruz). Sekundært antistof: Peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret gede-anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) anvendt i en fortynding på 1:3000 (Pierce). HRP-konjugeret gede-anti-mus IgG blev anvendt i en fortynding på 1:3000 (Pierce). Immunresponszonen blev observeret ved hjælp af kemiluminescensmetoden med SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Som beskrevet i (31) blev et naturligt immunpræcipitationsforsøg udført på den berigede ER-fraktion. Kort sagt, gærceller blev vasket med TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid og proteasehæmmerblanding) ved 600 nm (OD600) ved 100 optisk densitet to gange. Den blev brudt med glasperler, og derefter blev cellerester og glasperler fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev derefter centrifugeret ved 17.000 g i 15 minutter ved 4°C. Pelleten blev resuspenderet i TNE, og digitalis-saponin blev tilsat til en slutkoncentration på 1%. Suspensionen blev inkuberet i 1 time under rotation ved 4°C, og derefter blev de uopløselige komponenter fjernet ved centrifugering ved 13.000 g ved 4°C i 60 minutter. For Gas1-GFP-immunpræcipitation skal prøven først præinkuberes med tomme agarosekugler (ChromoTek) ved 4°C i 1 time, og derefter inkuberes med GFP-Trap_A (ChromoTek) ved 4°C i 3 timer. De immunpræcipiterede kugler blev vasket fem gange med TNE indeholdende 0,2% digoxigenin, elueret med SDS-prøvebuffer, separeret på SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting.
Som beskrevet i (31) blev tværbindingsbestemmelse udført på den berigede ER-fraktion. Kort fortalt blev den berigede ER-fraktion inkuberet med 0,5 mM dithiobis(succinimidylpropionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Tværbindingsreaktionen blev afbrudt ved tilsætning af glycin (50 mM slutkoncentration, 5 minutter, 20°C).
Som tidligere beskrevet (50) blev der udført MS-analyse af ceramid i vildtype- og GhLag1-stammer. Kort sagt blev cellerne dyrket til eksponentiel fase (3 til 4 OD600 enheder/ml) i YPD ved 30°C, og 25×107 celler blev høstet. Deres metabolisme blev hæmmet med trichloreddikesyre. Der anvendes ekstraktionsopløsningsmiddel [ethanol, vand, ether, pyridin og 4,2 N ammoniumhydroxid (15:15:5:1:0,018 v/v)] og 1,2 nmol intern standard C17 ceramid (860517, Avanti polær lipid) kvalitet). Der anvendes monomethylaminreagens [methanol, vand, n-butanol og methylaminopløsning (4:3:1:5 v/v)] til at udføre mild alkalisk hydrolyse af ekstraktet, og derefter anvendes vandmættet n-butanol til afsaltning. Endelig blev ekstraktet resuspenderet i et positivt opløsningsmiddel [chloroform/methanol/vand (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetat] og injiceret i massespektrometeret. Multireaktionsmonitorering (MRM) blev udført til identifikation og kvantificering af sphingolipidmolekyler. TSQ Vantage tertiær quadrupol massespektrometeret (Thermo Fisher Scientific) er udstyret med en robotbaseret nanoflow-ionkilde, Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) til lipidanalyse. Kollisionsenergien er optimeret for hver ceramidkategori. MS-data blev opnået i positiv tilstand. For hvert biologisk replikat er lipidsignalet medianen af ​​tre uafhængige målinger.
Som beskrevet i (31) blev cellerne (800×107), der udtrykte Gas1-GFP, underkastet naturlig immunpræcipitation. Det oprensede Gas1-GFP blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran. Proteinet blev visualiseret ved at farve PVDF med amidsort. Gas1-GFP-båndet blev skåret fra PVDF'en og vasket 5 gange med methanol og én gang med vand af væskekromatografi-MS (LC-MS)-kvalitet. Ved at inkubere membranstrimlen med 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer og 500 μl frisk opløst 1 M natriumnitritblanding ved 37°C i 3 timer frigives lipidfraktionen fra Gas1-GFP og lyseres. Frigivelse af inosinfosfatceramid mellem glucosamin og inositol (51). Derefter blev membranstrimlen vasket fire gange med vand af LC-MS-kvalitet, tørret ved stuetemperatur og opbevaret i en nitrogenatmosfære ved -80°C indtil analyse. Som kontrol blev en blindprøve af PVDF-membran anvendt til hvert eksperiment. Lipidet ekstraheret fra Gas1-GFP blev derefter analyseret ved MS som beskrevet (50). Kort sagt blev PVDF-strimler indeholdende GPI-lipid resuspenderet i 75 μl negativt formopløsningsmiddel [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammoniumacetat] og bestået elektrosprayionisering (ESI)-MRM/MS-analyse af sphingolipidarter (TSQ Vantage). I dette tilfælde blev MS-data opnået i negativ iontilstand.
Som tidligere nævnt blev lipiddelen af ​​GPI-ankeret separeret fra den [3H]-inositol-mærkede GPI-AP (16). Lipiderne blev separeret ved tyndtlagskromatografi under anvendelse af et opløsningsmiddelsystem (55:45:10 chloroform-methanol-0,25% KCl) og visualiseret ved hjælp af FLA-7000 (Fujifilm).
Cellerne, der udtrykte Gas1-GFP (600×107), blev vasket to gange med TNE-buffer, brudt med glasperler og derefter centrifugeret for at fjerne cellerester og glasperler. Supernatanten blev derefter centrifugeret ved 17.000 g i 1 time ved 4°C. Pelleten blev vasket i TNE og inkuberet med 1 U PI-PLC (Invitrogen) i TNE indeholdende 0,2% digitalis-saponin i 1 time ved 37°C. Efter enzymbehandlingen blev membranen fjernet ved centrifugering ved 17.000 g ved 4°C i 1 time. For at immunpræcipitere Gas1-GFP blev supernatanten inkuberet med GFP-Trap_A (ChromoTek) ved 4°C natten over. Den oprensede Gas1-GFP, der blev separeret ved SDS-PAGE, blev farvet med Coomassie Brilliant Blue. Gas1-GFP-farvningsbåndet blev afskåret fra det grå område omkring akvædukten, og efter alkylering med iodacetamid og reduktion med dithiothreitol blev der udført in-gel-fordøjelse med trypsin. Ekstraher og tør tryptiske peptider og peptider med GPI-glycaner. Det tørrede peptid blev opløst i 20 μl vand. Injicer en portion (8μl) i LC'en. En octadecylsilan (ODS)-søjle (Develosil 300ODS-HG-5; indre diameter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) blev brugt til at separere peptider under specifikke gradientbetingelser. Den mobile fase er opløsningsmiddel A (0,08% myresyre) og opløsningsmiddel B (0,15% myresyre i 80% acetonitril). Et Accela HPLC-system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) blev brugt til at eluere søjlen med opløsningsmiddel A inden for 55 minutter ved en flowhastighed på 50 μl min-1 i 5 minutter, og derefter blev koncentrationen af ​​opløsningsmiddel B øget til 40%. (USA). Eluatet blev kontinuerligt introduceret i ESI-ionkilden, og de tryptiske peptider og peptider med GPI-glykaner blev analyseret ved hjælp af LTQ Orbitrap XL (hybrid lineær ionfælde-orbitrap massespektrometer; Thermo Fisher Scientific). I MS-opsætningen blev spændingen på kapillærkilden indstillet til 4,5 kV, og temperaturen på transferkapillærrøret blev holdt ved 300 °C. Kapillærspændingen og rørlinsespændingen blev indstillet til henholdsvis 15 V og 50 V. MS-data blev opnået i positiv iontilstand (opløsning på 60.000; massenøjagtighed på 10 ppm) i et masseområde på 300/m/z masse/ladningsforhold (m/z) 3000. MS/MS-dataene opnås gennem ionfælden i LTQ Orbitrap XL [de første 3 cifre, som dataene afhænger af, kollisionsinduceret dissociation (CID)].
MD-simuleringer blev udført ved hjælp af GROMACS (52) software og MARTINI 2 kraftfelt (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) blev derefter brugt til at konstruere et dobbeltlag indeholdende dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) og Cer C18 eller DOPC og Cer C26. Topologien og koordinaterne for Cer C26 er afledt af DXCE ved at fjerne de ekstra perler fra sphingosinhalen. Brug processen beskrevet nedenfor til at afbalancere dobbeltlaget og kør det, og brug derefter systemets sidste koordinater til at opbygge et system indeholdende Emp24. Det transmembrane domæne af gæren Emp24 (resterne 173 til 193) blev konstrueret som en α-helix ved hjælp af det visuelle MD (VMD) værktøjs molekylære struktur (58). Derefter, efter fjernelse af de overlappende lipider, blev proteinet groftgranuleret og indsat i dobbeltlaget ved hjælp af CHARMM GUI. Det endelige system indeholder 1202 DOPC og 302 Cer C26 eller 1197 DOPC og 295 Cer C18 og Emp24. Ioniser systemet til en koncentration på 0,150 M. Fire uafhængige replikater blev lavet for to dobbeltlagssammensætninger.
Lipid-dobbeltlaget afbalanceres ved hjælp af CHARMM GUI-processen, som involverer minimering og derefter afbalancering af 405.000 trin, hvor positionsbegrænsningerne gradvist reduceres og elimineres, og tidstrinnet øges fra 0,005 ps til 0,02 ps. Efter ligevægt produceres 6 µs med et tidstrin på 0,02 ps. Efter indsættelse af Emp24 skal den samme CHARMM GUI-proces bruges til at minimere og afbalancere systemet, og derefter køres det i 8 sekunder i produktion.
For alle systemer styres trykket under afbalanceringsprocessen af ​​Berendsen-barostaten (59), og under produktionsprocessen styres trykket af Parrinello-Rahman-barostaten (60). I alle tilfælde er gennemsnitstrykket 1 bar, og der anvendes en semi-isotropisk trykkoblingsordning. I afbalancerings- og produktionsprocessen anvendes en termostat (61) med hastighedsrekalibrering til at koble temperaturen på henholdsvis protein-, lipid- og opløsningsmiddelpartikler. Under hele operationen er måltemperaturen 310 K. Den ikke-bindende interaktion beregnes ved at generere en parringsliste ved hjælp af Verlet-ordningen med en buffertolerance på 0,005. Coulomb-leddet beregnes ved hjælp af reaktionsfeltet og en afskæringsafstand på 1,1 nm. Vander Waals-leddet anvender en afskæringsordning med en afskæringsafstand på 1,1 nm, og Verlet-afskæringsordningen anvendes til potentiel drift (62).
Ved hjælp af VMD er afskæringsbølgelængden mellem DOPC-fosfatperler eller ceramid AM1-perler og proteinet 0,7 nm, og antallet af lipider, der interagerer med proteinet, beregnes. Beregn depleterings-berigelsesfaktoren (DE) som i (63) ved hjælp af følgende formel: DE-faktor = (mængden af ​​totale lipider i proteinet 0,7) i proteinet 0,7 (mængden af ​​Cer i totale lipider)
Den rapporterede værdi opnås som et gennemsnit, og fejlsøjlerne er fire uafhængige kopier af SE. Den statistiske signifikans af DE-faktoren beregnes ved t-test [(gennemsnitlig DE-faktor-1)/SE]. Beregn P-værdien ud fra den ensidede fordeling.
GROMACS-værktøjet blev brugt til at beregne det 2D laterale tæthedskort af systemet, der indeholder Emp24, inden for de sidste 250 ns af sporet. For at opnå berigelses-/udtømningskortet for ceramid divideres tæthedskortet for Cer med summen af ​​kortet over Cer og DOPC og derefter med koncentrationen af ​​Cer i kroppen. Den samme farvekortskala anvendes.
For supplerende materiale til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillader brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, så længe den endelige anvendelse ikke er til kommerciel gevinst, og forudsætningen er, at det originale værk er korrekt. Reference.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at den ikke er spam. Vi indsamler ikke nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende, og til at forhindre automatisk spamindsendelse.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero (Serez-Linero), Miergio Perez (Linero) (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-billeddannelse i høj opløsning i realtid afslører vigtigheden af ​​ceramidkædelængden for proteinsortering i selektive outputsteder.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero (Serez-Linero), Miergio Perez (Linero) (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-billeddannelse i høj opløsning i realtid afslører vigtigheden af ​​ceramidkædelængden for proteinsortering i selektive outputsteder.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheder forbeholdes. AAAS er partner med HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.