Tak fordi du besøger nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi at bruge den nyeste browserversion (eller at deaktivere kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). Derudover vil dette websted ikke indeholde stilarter eller JavaScript for at sikre fortsat understøttelse.
Hydrogensulfid (H2S) har flere fysiologiske og patologiske virkninger på den menneskelige krop. Natriumhydrosulfid (NaHS) anvendes i vid udstrækning som et farmakologisk værktøj til at evaluere virkningerne af H2S i biologiske eksperimenter. Selvom tabet af H2S fra NaHS-opløsninger kun tager et par minutter, er NaHS-opløsninger blevet brugt som donorforbindelser til H2S i drikkevand i nogle dyreforsøg. Denne undersøgelse undersøgte, om drikkevand med en NaHS-koncentration på 30 μM fremstillet i rotte-/museflasker kunne forblive stabilt i mindst 12-24 timer, som foreslået af nogle forfattere. Forbered en opløsning af NaHS (30 μM) i drikkevand og hæld den straks i rotte-/musevandflasker. Prøver blev indsamlet fra spidsen og indersiden af ​​vandflasken efter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 og 24 timer for at måle sulfidindholdet ved hjælp af methylenblåt-metoden. Derudover blev han- og hunrotter injiceret med NaHS (30 μM) i to uger, og serumsulfidkoncentrationerne blev målt hver anden dag i den første uge og ved udgangen af ​​den anden uge. NaHS-opløsningen i prøven taget fra spidsen af ​​vandflasken var ustabil; den faldt med 72 % og 75 % efter henholdsvis 12 og 24 timer. I prøver taget fra indersiden af ​​vandflaskerne var faldet i NaHS ikke signifikant inden for 2 timer; det faldt dog med 47 % og 72 % efter henholdsvis 12 og 24 timer. NaHS-injektion påvirkede ikke serumsulfidniveauet hos han- og hunrotter. Afslutningsvis bør NaHS-opløsninger fremstillet af drikkevand ikke anvendes til H2S-donation, da opløsningen er ustabil. Denne administrationsvej vil udsætte dyr for uregelmæssige og mindre end forventede mængder NaHS.
Hydrogensulfid (H2S) er blevet brugt som et toksin siden 1700; dets mulige rolle som et endogent biosignalmolekyle blev dog beskrevet af Abe og Kimura i 1996. I løbet af de sidste tre årtier er adskillige funktioner af H2S i forskellige menneskelige systemer blevet belyst, hvilket har ført til erkendelsen af, at H2S-donormolekyler kan have kliniske anvendelser i behandlingen eller håndteringen af ​​visse sygdomme; se Chirino et al. for en nylig gennemgang.
Natriumhydrosulfid (NaHS) er blevet anvendt i vid udstrækning som et farmakologisk værktøj til at vurdere virkningerne af H2S i mange cellekultur- og dyreforsøg5,6,7,8. NaHS er dog ikke en ideel H2S-donor, fordi det hurtigt omdannes til H2S/HS- i opløsning, let kontamineres med polysulfider og let oxideres og fordampes4,9. I mange biologiske eksperimenter opløses NaHS i vand, hvilket resulterer i passiv fordampning og tab af H2S10,11,12, spontan oxidation af H2S11,12,13 og fotolyse14. Sulfid i den oprindelige opløsning går meget hurtigt tabt på grund af fordampning af H2S11. I en åben beholder er halveringstiden (t1/2) for H2S ca. 5 minutter, og dens koncentration falder med ca. 13 % pr. minut10. Selvom tabet af hydrogensulfid fra NaHS-opløsninger kun tager et par minutter, har nogle dyreforsøg brugt NaHS-opløsninger som en kilde til hydrogensulfid i drikkevand i 1-21 uger, hvor den NaHS-holdige opløsning er udskiftet hver 12.-24. time.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Denne praksis er ikke i overensstemmelse med principperne for videnskabelig forskning, da lægemiddeldoseringer bør være baseret på deres anvendelse i andre arter, især mennesker.27
Præklinisk forskning inden for biomedicin sigter mod at forbedre kvaliteten af ​​patientpleje eller behandlingsresultater. Resultaterne af de fleste dyreforsøg er dog endnu ikke blevet oversat til mennesker28,29,30. En af årsagerne til denne translationelle fiasko er manglen på opmærksomhed på den metodologiske kvalitet af dyreforsøg30. Formålet med denne undersøgelse var derfor at undersøge, om 30 μM NaHS-opløsninger fremstillet i rotte-/musevandflasker kunne forblive stabile i drikkevand i 12-24 timer, som hævdet eller foreslået i nogle undersøgelser.
Alle eksperimenter i dette studie blev udført i overensstemmelse med de offentliggjorte retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr i Iran31. Alle forsøgsrapporter i dette studie fulgte også ARRIVE-retningslinjerne32. Den Etiske Komité ved Instituttet for Endokrine Videnskaber, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, godkendte alle forsøgsprocedurer i dette studie.
Zinkacetatdihydrat (CAS: 5970-45-6) og vandfrit jernchlorid (CAS: 7705-08-0) blev købt fra Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Frankrig). Natriumhydrosulfidhydrat (CAS: 207683-19-0) og N,N-dimethyl-p-phenylendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isofluran blev købt fra Piramal (Bethlehem, PA, USA). Saltsyre (HCl) blev købt fra Merck (Darmstadt, Tyskland).
Forbered en opløsning af NaHS (30 μM) i drikkevand og hæld den straks i rotte-/musevandflaskerne. Denne koncentration blev valgt baseret på adskillige publikationer, der bruger NaHS som kilde til H2S; se diskussionsafsnittet. NaHS er et hydreret molekyle, der kan indeholde varierende mængder hydreringsvand (dvs. NaHS•xH2O); ifølge producenten var den anvendte procentdel af NaHS i vores undersøgelse 70,7% (dvs. NaHS•1,3 H2O), og vi tog højde for denne værdi i vores beregninger, hvor vi brugte en molekylvægt på 56,06 g/mol, hvilket er molekylvægten af ​​vandfrit NaHS. Hydreringsvand (også kaldet krystalvand) er de vandmolekyler, der udgør den krystallinske struktur33. Hydrater har forskellige fysiske og termodynamiske egenskaber sammenlignet med anhydrater34.
Før NaHS tilsættes drikkevandet, måles opløsningsmidlets pH og temperatur. Hæld straks NaHS-opløsningen i rotte-/musevandflasken i dyreburet. Prøver blev indsamlet fra spidsen og fra indersiden af ​​vandflasken efter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 og 24 timer for at måle sulfidindholdet. Sulfidmålinger blev taget umiddelbart efter hver prøveudtagning. Vi fik prøver fra spidsen af ​​røret, fordi nogle undersøgelser har vist, at vandrørets lille porestørrelse kan minimere H2S-fordampning15,19. Dette problem ser også ud til at gælde for opløsningen i flasken. Dette var dog ikke tilfældet for opløsningen i vandflaskens hals, som havde en højere fordampningshastighed og var autooxiderende; faktisk drak dyrene dette vand først.
Han- og hun-Wistar-rotter blev anvendt i undersøgelsen. Rotterne blev holdt i polypropylenbure (2-3 rotter pr. bur) under standardforhold (temperatur 21-26 °C, luftfugtighed 32-40%) med 12 timers lys (kl. 7-19) og 12 timers mørke (kl. 19-7). Rotterne havde fri adgang til postevand og blev fodret med standardfoder (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Aldersmatchede (6 måneder) hun- (n=10, kropsvægt: 190-230 g) og han- (n=10, kropsvægt: 320-370 g) Wistar-rotter blev tilfældigt opdelt i kontrolgrupper og grupper behandlet med NaHS (30 μM) (n=5 pr. gruppe). For at bestemme stikprøvestørrelsen anvendte vi KISS (Keep It Simple, Stupid)-tilgangen, som kombinerer tidligere erfaring og poweranalyse35. Vi udførte først et pilotstudie på 3 rotter og bestemte det gennemsnitlige serum totale sulfidniveau og standardafvigelsen (8,1 ± 0,81 μM). Derefter bestemte vi, med 80% styrke og et tosidet signifikansniveau på 5%, en foreløbig stikprøvestørrelse (n = 5 baseret på tidligere litteratur), der svarede til en standardiseret effektstørrelse på 2,02 med den foruddefinerede værdi foreslået af Festing til beregning af stikprøvestørrelsen for forsøgsdyr35. Efter at have ganget denne værdi med SD (2,02 × 0,81) var den forudsagte detekterbare effektstørrelse (1,6 μM) 20%, hvilket er acceptabelt. Det betyder, at n = 5/gruppe er tilstrækkeligt til at detektere en gennemsnitlig ændring på 20% mellem grupperne. Rotter blev tilfældigt opdelt i kontrol- og NaSH-behandlede grupper ved hjælp af den tilfældige funktion i Excel-softwaren36 (Supplerende Fig. 1). Blinding blev udført på resultatniveau, og de forskere, der udførte de biokemiske målinger, var ikke klar over gruppetildelingerne.
NaHS-grupperne af begge køn blev behandlet med 30 μM NaHS-opløsning fremstillet i drikkevand i 2 uger. Frisk opløsning blev tilført hver 24. time, i hvilken periode kropsvægten blev målt. Blodprøver blev indsamlet fra halespidserne af alle rotter under isoflurananæstesi hver anden dag i slutningen af ​​den første og anden uge. Blodprøverne blev centrifugeret ved 3000 g i 10 minutter, serum blev separeret og opbevaret ved -80 °C til efterfølgende måling af serumurinstof, kreatinin (Cr) og total sulfid. Serumurinstof blev bestemt ved enzymatisk ureasemetode, og serumkreatinin blev bestemt ved fotometrisk Jaffe-metode ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (Man Company, Teheran, Iran) og en automatisk analysator (Selectra E, serienummer 0-2124, Holland). Intra- og interassay variationskoefficienterne for urinstof og Cr var mindre end 2,5%.
Methylenblåt (MB)-metoden bruges til at måle total sulfid i drikkevand og serum indeholdende NaHS; MB er den mest almindeligt anvendte metode til måling af sulfid i bulkopløsninger og biologiske prøver11,37. MB-metoden kan bruges til at estimere den samlede sulfidpulje38 og måle uorganiske sulfider i form af H2S, HS- og S2 i den vandige fase39. I denne metode udfældes svovl som zinksulfid (ZnS) i nærvær af zinkacetat11,38. Zinkacetatudfældning er den mest anvendte metode til at adskille sulfider fra andre kromoforer11. ZnS blev genopløst ved hjælp af HCl11 under stærkt sure forhold. Sulfidet reagerer med DMPD i et støkiometrisk forhold på 1:2 i en reaktion katalyseret af jernchlorid (Fe3+ fungerer som et oxidationsmiddel) for at danne farvestoffet MB, som detekteres spektrofotometrisk ved 670 nm40,41. Detektionsgrænsen for MB-metoden er cirka 1 μM11.
I dette studie blev 100 μL af hver prøve (opløsning eller serum) tilsat et rør; derefter blev 200 μL zinkacetat (1% w/v i destilleret vand), 100 μL DMPD (20 mM i 7,2 M HCl) og 133 μL FeCl3 (30 mM i 1,2 M HCl) tilsat. Blandingen blev inkuberet ved 37°C i mørke i 30 minutter. Opløsningen blev centrifugeret ved 10.000 g i 10 minutter, og supernatantens absorbans blev aflæst ved 670 nm ved hjælp af en mikropladelæser (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Sulfidkoncentrationer blev bestemt ved hjælp af en kalibreringskurve for NaHS (0-100 μM) i ddH2O (supplerende figur 2). Alle opløsninger, der blev brugt til målingerne, var frisk fremstillede. Intra- og interassay-variationskoefficienterne for sulfidmålinger var henholdsvis 2,8 % og 3,4 %. Vi bestemte også den samlede sulfidindsamling fra natriumthiosulfatholdige drikkevands- og serumprøver ved hjælp af den berigede prøvemetode42. Indsamlingen for natriumthiosulfatholdige drikkevands- og serumprøver var henholdsvis 91 ± 1,1 % (n = 6) og 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software version 8.0.2 til Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). En parret t-test blev brugt til at sammenligne temperatur og pH i drikkevand før og efter tilsætning af NaHS. Tabet af H2S i den NaHS-holdige opløsning blev beregnet som et procentvis fald fra baseline-optagelse, og for at vurdere, om tabet var statistisk signifikant, udførte vi en envejs gentagne ANOVA efterfulgt af Dunnett's multiple sammenligningstest. Kropsvægt, serumurinstof, serumkreatinin og total serumsulfid over tid blev sammenlignet mellem kontrol- og NaHS-behandlede rotter af forskellige køn ved hjælp af en tovejs blandet (mellem-inden) ANOVA efterfulgt af en Bonferroni post hoc-test. Tosidede P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.
Drikkevandets pH-værdi var 7,60 ± 0,01 før tilsætning af NaHS og 7,71 ± 0,03 efter tilsætning af NaHS (n = 13, p = 0,0029). Drikkevandets temperatur var 26,5 ± 0,2 og faldt til 26,2 ± 0,2 efter tilsætning af NaHS (n = 13, p = 0,0128). Forbered 30 μM NaHS-opløsning i drikkevand og opbevar den i en vandflaske. NaHS-opløsningen er ustabil, og dens koncentration falder over tid. Ved prøveudtagning fra vandflaskens hals blev der observeret et signifikant fald (68,0%) inden for den første time, og NaHS-indholdet i opløsningen faldt med 72% og 75% efter henholdsvis 12 og 24 timer. I prøver fra vandflasker var reduktionen i NaHS ikke signifikant op til 2 timer, men efter 12 og 24 timer var den faldet med henholdsvis 47% og 72%. Disse data indikerer, at procentdelen af ​​NaHS i en 30 μM opløsning fremstillet i drikkevand var faldet til cirka en fjerdedel af den oprindelige værdi efter 24 timer, uanset prøveudtagningssted (figur 1).
Stabilitet af NaHS-opløsning (30 μM) i drikkevand i rotte-/museflasker. Efter opløsningsforberedelse blev der taget prøver fra spidsen og det indre af vandflasken. Data præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 6/gruppe). * og #, P < 0,05 sammenlignet med tid 0. Fotografiet af vandflasken viser spidsen (med åbning) og flaskens krop. Spidsvolumenet er cirka 740 μL.
Koncentrationen af ​​NaHS i den frisk fremstillede 30 μM opløsning var 30,3 ± 0,4 μM (interval: 28,7-31,9 μM, n = 12). Efter 24 timer faldt koncentrationen af ​​NaHS dog til en lavere værdi (gennemsnit: 3,0 ± 0,6 μM). Som vist i figur 2 var de koncentrationer af NaHS, som rotterne blev udsat for, ikke konstante i løbet af undersøgelsesperioden.
Hunrotters kropsvægt steg signifikant over tid (fra 205,2 ± 5,2 g til 213,8 ​​± 7,0 g i kontrolgruppen og fra 204,0 ± 8,6 g til 211,8 ± 7,5 g i den NaHS-behandlede gruppe); NaHS-behandling havde dog ingen effekt på kropsvægten (fig. 3). Hanrotters kropsvægt steg signifikant over tid (fra 338,6 ± 8,3 g til 352,4 ± 6,0 g i kontrolgruppen og fra 352,4 ± 5,9 g til 363,2 ± 4,3 g i den NaHS-behandlede gruppe); NaHS-behandling havde dog ingen effekt på kropsvægten (fig. 3).
Ændringer i kropsvægt hos hun- og hanrotter efter administration af NaHS (30 μM). Data præsenteres som middelværdi ± SEM og blev sammenlignet ved hjælp af tovejs blandet (inden for-mellem) variansanalyse med Bonferroni post hoc-test. n = 5 af hvert køn i hver gruppe.
Serumurinstof- og kreatinfosfatkoncentrationerne var sammenlignelige hos kontrolrotter og NaSH-behandlede rotter gennem hele studiet. Desuden påvirkede NaSH-behandling ikke serumurinstof- og kreatinikromkoncentrationerne (Tabel 1).
Baseline serumkoncentrationerne af total sulfid var sammenlignelige mellem kontrolgruppen og NaHS-behandlede hanrotter (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) og hunrotter (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM). NaHS-administration i 14 dage havde ingen effekt på serumniveauerne af total sulfid hos hverken han- eller hunrotter (fig. 4).
Ændringer i serumkoncentrationer af total sulfid hos han- og hunrotter efter administration af NaHS (30 μM). Data præsenteres som middelværdi ± SEM og blev sammenlignet ved hjælp af en tovejs blandet (inden for-inden) variansanalyse med Bonferroni post hoc-test. Hvert køn, n = 5/gruppe.
Hovedkonklusionen af ​​dette studie er, at drikkevand indeholdende NaHS er ustabilt: kun omkring en fjerdedel af det oprindelige samlede sulfidindhold kan detekteres 24 timer efter prøveudtagning fra spidsen og indersiden af ​​rotte-/musevandflasker. Desuden blev rotter udsat for ustabile NaHS-koncentrationer på grund af tabet af H2S i NaHS-opløsningen, og tilsætningen af ​​NaHS til drikkevand påvirkede ikke kropsvægt, serumurinstof og kreatinkrom eller total serumsulfid.
I denne undersøgelse var tabshastigheden for H2S fra 30 μM NaHS-opløsninger fremstillet i drikkevand cirka 3% i timen. I en bufferet opløsning (100 μM natriumsulfid i 10 mM PBS, pH 7,4) blev det rapporteret, at sulfidkoncentrationen faldt med 7% over tid i løbet af 8 timer. Vi har tidligere forsvaret intraperitoneal administration af NaHS ved at rapportere, at tabshastigheden for sulfid fra en 54 μM NaHS-opløsning i drikkevand var cirka 2,3% i timen (4%/time i de første 12 timer og 1,4%/time i de sidste 12 timer efter fremstilling)8. Tidligere undersøgelser43 fandt et konstant tab af H2S fra NaHS-opløsninger, primært på grund af fordampning og oxidation. Selv uden tilsætning af bobler tabes sulfid i stamopløsningen hurtigt på grund af H2S-fordampning11. Undersøgelser har vist, at der under fortyndingsprocessen, som tager omkring 30-60 sekunder, går omkring 5-10 % H2S tabt på grund af fordampning6. For at forhindre fordampning af H2S fra opløsningen har forskere taget adskillige forholdsregler, herunder forsigtig omrøring af opløsningen12, dækning af stamopløsningen med plastfilm6 og minimering af opløsningens eksponering for luft, da H2S-fordampningshastigheden afhænger af luft-væske-grænsefladen.13 Spontan oxidation af H2S forekommer hovedsageligt på grund af overgangsmetalioner, især jern(III)-jern, som er urenheder i vand.13 Oxidation af H2S resulterer i dannelsen af ​​polysulfider (svovlatomer forbundet med kovalente bindinger)11. For at undgå oxidation fremstilles opløsninger indeholdende H2S i deoxygenerede opløsningsmidler44,45 og renses derefter med argon eller nitrogen i 20-30 minutter for at sikre deoxygenering.11,12,37,44,45,46 Diethylentriaminpentoeddikesyre (DTPA) er en metalchelator (10-4 M), der forhindrer HS- autooxidation i aerobe opløsninger. I fravær af DTPA er autooxidationshastigheden for HS- cirka 50 % over cirka 3 timer ved 25°C37,47. Da oxidationen af ​​1e-sulfid katalyseres af ultraviolet lys, bør opløsningen desuden opbevares på is og beskyttes mod lys11.
Som vist i figur 5 dissocieres NaHS til Na+ og HS-6, når det opløses i vand; denne dissociation bestemmes af reaktionens pK1, som er temperaturafhængig: pK1 = 3,122 + 1132/T, hvor T varierer fra 5 til 30°C og måles i grader Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- har en høj pK2 (pK2 = 19), så ved pH < 96,49 dannes S2- ikke eller dannes i meget små mængder. I modsætning hertil fungerer HS- som en base og accepterer H+ fra et H2O-molekyle, og H2O fungerer som en syre og omdannes til H2S og OH-.
Dannelse af opløst H2S-gas i NaHS-opløsning (30 µM). aq, vandig opløsning; g, gas; l, væske. Alle beregninger antager, at vandets pH = 7,0 og vandtemperaturen = 20 °C. Oprettet med BioRender.com.
Trods beviser for, at NaHS-opløsninger er ustabile, har adskillige dyreforsøg anvendt NaHS-opløsninger i drikkevand som en H2S-donorforbindelse15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 med interventionsvarigheder fra 1 til 21 uger (Tabel 2). Under disse undersøgelser blev NaHS-opløsningen fornyet hver 12., 15., 17., 18., 24., 25. eller 24., 19., 20., 21., 22., 23. time. Vores resultater viste, at rotter blev udsat for ustabile lægemiddelkoncentrationer på grund af tabet af H2S fra NaHS-opløsningen, og NaHS-indholdet i rotternes drikkevand fluktuerede signifikant over 12 eller 24 timer (se figur 2). To af disse studier rapporterede, at H2S-niveauerne i vand forblev stabile i løbet af 24 timer22, eller at der kun blev observeret 2-3% H2S-tab i løbet af 12 timer15, men de gav ikke understøttende data eller måledetaljer. To studier har vist, at den lille diameter af vandflasker kan minimere H2S-fordampning15,19. Vores resultater viste dog, at dette muligvis kun forsinker H2S-tabet fra en vandflaske med 2 timer i stedet for 12-24 timer. Begge studier bemærker, at vi antager, at NaHS-niveauet i drikkevandet ikke ændrede sig, fordi vi ikke observerede en farveændring i vandet; derfor var oxidation af H2S med luft ikke signifikant19,20. Overraskende nok vurderer denne subjektive metode stabiliteten af ​​NaHS i vand i stedet for at måle ændringen i dets koncentration over tid.
Tabet af H2S i NaHS-opløsning er relateret til pH og temperatur. Som nævnt i vores undersøgelse resulterer opløsning af NaHS i vand i dannelsen af ​​en alkalisk opløsning50. Når NaHS opløses i vand, afhænger dannelsen af ​​opløst H2S-gas af pH-værdien6. Jo lavere opløsningens pH er, desto større er andelen af ​​NaHS til stede som H2S-gasmolekyler, og desto mere sulfid går tabt fra den vandige opløsning11. Ingen af ​​disse undersøgelser rapporterede pH-værdien i drikkevand, der anvendes som opløsningsmiddel til NaHS. Ifølge WHO's anbefalinger, som er vedtaget af de fleste lande, bør drikkevandets pH-værdi ligge i området 6,5-8,551. I dette pH-område øges hastigheden af ​​spontan oxidation af H2S cirka ti gange13. Opløsning af NaHS i vand i dette pH-område vil resultere i en opløst H2S-gaskoncentration på 1 til 22,5 μM, hvilket understreger vigtigheden af ​​at overvåge vandets pH-værdi, før NaHS opløses. Derudover ville temperaturintervallet rapporteret i ovenstående undersøgelse (18-26 °C) resultere i en ændring i koncentrationen af ​​opløst H2S-gas i opløsningen på cirka 10%, da temperaturændringer ændrer pK1, og små ændringer i pK1 kan have en betydelig indvirkning på koncentrationen af ​​opløst H2S-gas48. Derudover forværrer den lange varighed af nogle undersøgelser (5 måneder)22, hvor der forventes stor temperaturvariation, også dette problem.
Alle studier undtagen én21 anvendte 30 μM NaHS-opløsning i drikkevand. For at forklare den anvendte dosis (dvs. 30 μM) påpegede nogle forfattere, at NaHS i den vandige fase producerer præcis den samme koncentration af H2S-gas, og at det fysiologiske område for H2S er 10 til 100 μM, så denne dosis ligger inden for det fysiologiske område15,16. Andre forklarede, at 30 μM NaHS kan opretholde plasma-H2S-niveauet inden for det fysiologiske område, dvs. 5-300 μM19,20. Vi betragter koncentrationen af ​​NaHS i vand på 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), som blev brugt i nogle studier til at undersøge virkningerne af H2S. Vi kan beregne, at koncentrationen af ​​opløst H2S-gas er 14,7 μM, hvilket er ca. 50 % af den oprindelige NaHS-koncentration. Denne værdi svarer til den værdi, der er beregnet af andre forfattere under de samme betingelser13,48.
I vores undersøgelse ændrede NaHS-administration ikke kropsvægten; dette resultat er i overensstemmelse med resultaterne af andre undersøgelser af hanmus22,23 og hanrotter18; To undersøgelser rapporterede dog, at NaSH gendannede den reducerede kropsvægt hos nefrektomiserede rotter24,26, hvorimod andre undersøgelser ikke rapporterede effekten af ​​NaSH-administration på kropsvægt15,16,17,19,20,21,25. Desuden påvirkede NaSH-administration i vores undersøgelse ikke serumurinstof- og kreatinkromniveauerne, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af en anden rapport25.
Undersøgelsen viste, at tilsætning af NaHS til drikkevand i 2 uger ikke påvirkede de samlede serumsulfidkoncentrationer hos han- og hunrotter. Dette fund stemmer overens med resultaterne fra Sen et al. (16): 8 ugers behandling med 30 μM NaHS i drikkevand påvirkede ikke plasmasulfidniveauerne hos kontrolrotter; de rapporterede dog, at denne intervention gendannede de nedsatte H2S-niveauer i plasma hos nefrektomiserede mus. Li et al. (22) rapporterede også, at behandling med 30 μM NaHS i drikkevand i 5 måneder øgede plasmaniveauerne af frit sulfid hos ældre mus med omkring 26%. Andre undersøgelser har ikke rapporteret ændringer i cirkulerende sulfid efter tilsætning af NaHS til drikkevand.
Syv studier rapporterede brugen af ​​Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, men gav ikke yderligere detaljer om hydreringsvand, og fem studier nævnte ikke kilden til NaHS, der blev anvendt i deres fremstillingsmetoder17,18,24,25,26. NaHS er et hydreret molekyle, og dets indhold af hydreringsvand kan variere, hvilket påvirker den mængde NaHS, der kræves for at fremstille en opløsning med en given molaritet. For eksempel var NaHS-indholdet i vores undersøgelse NaHS•1,3 H2O. De faktiske NaHS-koncentrationer i disse studier kan således være lavere end de rapporterede.
"Hvordan kan en så kortlivet forbindelse have en så langvarig effekt?" Pozgay et al.21 stillede dette spørgsmål, da de evaluerede virkningerne af NaHS på colitis hos mus. De håber, at fremtidige undersøgelser vil være i stand til at besvare dette spørgsmål og spekulere i, at NaHS-opløsninger kan indeholde mere stabile polysulfider ud over H2S og disulfider, der medierer effekten af ​​NaHS21. En anden mulighed er, at meget lave koncentrationer af NaHS, der forbliver i opløsning, også kan have en gavnlig effekt. Faktisk fremlagde Olson et al. bevis for, at mikromolære niveauer af H2S i blodet ikke er fysiologiske og bør være i det nanomolære område eller helt fraværende13. H2S kan virke gennem proteinsulfatering, en reversibel posttranslationel modifikation, der påvirker funktionen, stabiliteten og lokaliseringen af ​​mange proteiner52,53,54. Faktisk er cirka 10% til 25% af mange leverproteiner under fysiologiske forhold sulfyleret53. Begge studier anerkender den hurtige nedbrydning af NaHS19,23, men angiver overraskende nok, at "vi kontrollerede koncentrationen af ​​NaHS i drikkevand ved at udskifte det dagligt."23 Én undersøgelse angav ved et uheld, at "NaHS er en standard H2S-donor og bruges almindeligvis i klinisk praksis til at erstatte selve H2S."18
Ovenstående diskussion viser, at NaHS går tabt fra opløsning gennem fordampning, oxidation og fotolyse, og derfor fremsættes der nogle forslag til at reducere tabet af H2S fra opløsning. For det første afhænger fordampningen af ​​H2S af gas-væske-grænsefladen13 og opløsningens pH11; for at minimere fordampningstabet kan vandflaskens hals derfor gøres så lille som muligt som tidligere beskrevet15,19, og vandets pH kan justeres til en acceptabel øvre grænse (dvs. 6,5-8,551) for at minimere fordampningstabet11. For det andet forekommer spontan oxidation af H2S på grund af virkningerne af ilt og tilstedeværelsen af ​​overgangsmetalioner i drikkevand13, så deoxygenering af drikkevand med argon eller nitrogen44,45 og brugen af ​​metalchelatorer37,47 kan reducere oxidationen af ​​sulfider. For det tredje kan vandflasker indpakkes i aluminiumsfolie for at forhindre fotodekomponering af H2S; Denne praksis gælder også for lysfølsomme materialer såsom streptozotocin55. Endelig kan uorganiske sulfidsalte (NaHS, Na2S og CaS) administreres via sonde i stedet for at blive opløst i drikkevand, som tidligere rapporteret56,57,58; undersøgelser har vist, at radioaktivt natriumsulfid administreret via sonde til rotter absorberes godt og distribueres til stort set alle væv59. Til dato har de fleste undersøgelser administreret uorganiske sulfidsalte intraperitonealt; denne vej anvendes dog sjældent i kliniske sammenhænge60. På den anden side er den orale vej den mest almindelige og foretrukne administrationsvej hos mennesker61. Derfor anbefaler vi at evaluere virkningerne af H2S-donorer hos gnavere ved oral sonde.
En begrænsning er, at vi målte sulfid i vandig opløsning og serum ved hjælp af MB-metoden. Metoderne til måling af sulfid omfatter jodtitrering, spektrofotometri, elektrokemisk metode (potentiometri, amperometri, coulometrisk metode og amperometrisk metode) og kromatografi (gaskromatografi og højtydende væskekromatografi), hvoraf den mest almindeligt anvendte metode er MB-spektrofotometrimetoden62. En begrænsning ved MB-metoden til måling af H2S i biologiske prøver er, at den måler alle svovlholdige forbindelser og ikke frit H2S63, fordi den udføres under sure forhold, hvilket resulterer i ekstraktion af svovl fra den biologiske kilde64. Ifølge American Public Health Association er MB dog standardmetoden til måling af sulfid i vand65. Derfor påvirker denne begrænsning ikke vores hovedresultater om ustabiliteten af ​​opløsninger, der indeholder NaHS. Desuden var genfindingen af ​​sulfidmålinger i vand- og serumprøver, der indeholder NaHS, i vores undersøgelse henholdsvis 91% og 93%. Disse værdier er i overensstemmelse med tidligere rapporterede intervaller (77-92)66, hvilket indikerer acceptabel analytisk præcision42. Det er værd at bemærke, at vi anvendte både han- og hunrotter i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health (NIH) for at undgå overdreven afhængighed af kun handyreforsøg i prækliniske studier67 og for at inkludere både han- og hunrotter, når det er muligt68. Dette punkt er blevet understreget af andre69,70,71.
Afslutningsvis indikerer resultaterne af denne undersøgelse, at NaHS-opløsninger fremstillet af drikkevand ikke kan bruges til at generere H2S på grund af deres ustabilitet. Denne administrationsvej ville udsætte dyr for ustabile og lavere niveauer af NaHS end forventet; derfor er resultaterne muligvis ikke relevante for mennesker.
De datasæt, der er anvendt og/eller analyseret i den aktuelle undersøgelse, er tilgængelige fra den korresponderende forfatter efter rimelig anmodning.
Szabo, K. Tidslinje for forskning i hydrogensulfid (H2S): fra miljøtoksin til biologisk mediator. Biokemi og Farmakologi 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. og Kimura, H. Mulig rolle af hydrogensulfid som en endogen neuromodulator. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. og Papapetropoulos, A. Hydrogensulfids fysiologiske rolle i pattedyrsceller, væv og organer. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, og Kashfi, K. Udviklende løfter om cellulære leveringssystemer for nitrogenoxid og hydrogensulfid: en ny æra inden for personlig medicin. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Langvarig administration af en langsomt frigivende hydrogensulfiddonor kan forhindre myokardieiskæmi/reperfusionsskade. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM og Hermann, A. BK-kanalfosforylering regulerer hydrogensulfid (H2S) følsomhed. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM og Hermann, A. Hydrogensulfid forstærker aktiviteten af ​​calciumaktiverede kalium (BK)-kanaler i hypofysetumorceller hos rotter. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Hydrogensulfid forstærker den beskyttende effekt af nitrit mod myokardieiskæmi-reperfusionsskade hos type 2-diabetiske rotter. Nitrogenoxid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Tendenser i H2S-donorkemi og dens indvirkning på hjerte-kar-sygdomme. Antioxidanter 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, og Olson, KR (2012). Passive tab af hydrogensulfid i biologiske eksperimenter. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Kemiske aspekter af hydrogensulfidmålinger i fysiologiske prøver. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrisk bestemmelse af hydrogensulfid i naturlige vandveje. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktisk træning i hydrogensulfids kemi og biologi. “Antioxidanter.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).