Vi har tidligere rapporteret, at serumniveauer af den tarmafledte tryptofanmetabolit indol-3-propionsyre (IPA) er lavere hos patienter med leverfibrose. I dette studie undersøgte vi transkriptomet og DNA-methylomet i overvægtige lever i relation til serum-IPA-niveauer, samt IPAs rolle i at inducere fænotypisk inaktivering af hepatiske stellatceller (HSC'er) in vitro.
Studiet omfattede 116 overvægtige patienter uden type 2-diabetes mellitus (T2DM) (alder 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), som gennemgik fedmekirurgi på Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Cirkulerende IPA-niveauer blev målt ved hjælp af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), levertranskriptomanalyse blev udført ved hjælp af total RNA-sekventering, og DNA-methyleringsanalyse blev udført ved hjælp af Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Humane hepatiske stellatceller (LX-2) blev anvendt til in vitro-forsøg.
Serum-IPA-niveauer korrelerede med ekspressionen af ​​gener involveret i apoptotiske, mitofagiske og levetidsforlængende signalveje i leveren. AKT serin/threoninkinase 1 (AKT1)-genet var det mest udbredte og dominerende interagerende gen i levertranskriptet og DNA-methyleringsprofilerne. IPA-behandling inducerede apoptose, nedsatte mitokondriel respiration og ændrede cellemorfologi og mitokondriedynamik ved at modulere ekspressionen af ​​gener, der er kendt for at regulere fibrose, apoptose og overlevelse af LX-2-celler.
Samlet set understøtter disse data, at IPA har potentielle terapeutiske virkninger og kan inducere apoptose og flytte HSC-fænotypen mod en inaktiv tilstand, hvorved muligheden for at hæmme leverfibrose ved at interferere med HSC-aktivering og mitokondriel metabolisme udvides.
Forekomsten af ​​fedme og metabolisk syndrom er blevet forbundet med en stigende forekomst af metabolisk associeret fedtleversygdom (MASLD); sygdommen rammer 25% til 30% af den generelle befolkning [1]. Den primære konsekvens af MASLD-ætiologien er leverfibrose, en dynamisk proces karakteriseret ved kontinuerlig akkumulering af fibrøs ekstracellulær matrix (ECM) [2]. De primære celler involveret i leverfibrose er hepatiske stellatceller (HSC'er), som udviser fire kendte fænotyper: hvilende, aktiverede, inaktiverede og senescente [3, 4]. HSC'er kan aktiveres og transdifferentiere fra en hvilende form til proliferative fibroblastlignende celler med højt energibehov, med øget ekspression af α-glatmuskelaktin (α-SMA) og type I-kollagen (Col-I) [5, 6]. Under leverfibrose-reversering elimineres aktiverede HSC'er via apoptose eller inaktivering. Disse processer omfatter nedregulering af fibrogene gener og modulering af prosurvivalgener (såsom NF-κB og PI3K/Akt signalveje) [7, 8], samt ændringer i mitokondriedynamik og -funktion [9].
Serumniveauer af tryptofanmetabolitten indol-3-propionsyre (IPA), der produceres i tarmen, er blevet fundet at være nedsatte i forbindelse med menneskelige metaboliske sygdomme, herunder MASLD [10-13]. IPA er forbundet med indtag af kostfibre, er kendt for sine antioxidante og antiinflammatoriske virkninger og dæmper den diætinducerede ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH) fænotype in vivo og in vitro [11-14]. Nogle beviser kommer fra vores tidligere undersøgelse, som viste, at serum-IPA-niveauer var lavere hos patienter med leverfibrose end hos overvægtige patienter uden leverfibrose i Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Desuden viste vi, at IPA-behandling kunne reducere ekspressionen af ​​gener, der er klassiske markører for celleadhæsion, cellemigration og hæmatopoietisk stamcelleaktivering i en human hepatisk stellatcelle (LX-2) model og er en potentiel hepatoprotektiv metabolit [15]. Det er dog fortsat uklart, hvordan IPA inducerer leverfibrose-regression ved at aktivere HSC-apoptose og mitokondriel bioenergetik.
Her demonstrerer vi, at serum IPA er forbundet med ekspressionen af ​​gener beriget med apoptose, mitofagi og levetidsveje i leveren hos overvægtige personer, der ikke har type 2-diabetes (KOBS). Desuden fandt vi, at IPA kan inducere clearance og nedbrydning af aktiverede hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) via inaktiveringsvejen. Disse resultater afslører en ny rolle for IPA, hvilket gør det til et potentielt terapeutisk mål for at fremme leverfibrose-regression.
Et tidligere studie i KOBS-kohorten viste, at patienter med leverfibrose havde lavere cirkulerende IPA-niveauer sammenlignet med patienter uden leverfibrose [15]. For at udelukke den potentielle konfunderende effekt af type 2-diabetes rekrutterede vi 116 overvægtige patienter uden type 2-diabetes (gennemsnitsalder ± SD: 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) fra det igangværende KOBS-studie som studiepopulation [16]. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke, og studieprotokollen blev godkendt af den etiske komité på North Savo County Hospital i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen (54/2005, 104/2008 og 27/2010).
Leverbiopsiprøver blev taget under fedmekirurgi og histologisk vurderet af erfarne patologer i henhold til tidligere beskrevne kriterier [17, 18]. Vurderingskriterierne er opsummeret i supplerende tabel S1 og er tidligere beskrevet [19].
Fastende serumprøver blev analyseret ved hjælp af umålrettet væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) til metabolomisk analyse (n = 116). Prøverne blev analyseret ved hjælp af et UHPLC-qTOF-MS-system (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Tyskland) som tidligere beskrevet19. Identifikation af isopropylalkohol (IPA) var baseret på retentionstid og sammenligning af MS/MS-spektret med rene standarder. IPA-signalintensiteten (toparealet) blev taget i betragtning i alle yderligere analyser [20].
Hellever-RNA-sekventering blev udført ved hjælp af Illumina HiSeq 2500, og data blev forbehandlet som tidligere beskrevet [19, 21, 22]. Vi udførte målrettet differentiel ekspressionsanalyse af transkripter, der påvirker mitokondriefunktion/biogenese, ved hjælp af 1957 gener udvalgt fra MitoMiner 4.0-databasen [23]. Lever-DNA-methyleringsanalyse blev udført ved hjælp af Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) med samme metode som tidligere beskrevet [24, 25].
Humane hepatiske stellatceller (LX-2) blev venligst stillet til rådighed af professor Stefano Romeo og blev dyrket og vedligeholdt i DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). For at vælge den rette dosis af IPA blev LX-2-celler behandlet med forskellige koncentrationer af IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM; Sigma, 220027) i DMEM/F12-medium i 24 timer. For at undersøge IPAs evne til at inaktivere HSC'er blev LX-2-celler desuden behandlet med 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) og 1 mM IPA i serumfrit medium i 24 timer. For de tilsvarende vehikelkontroller blev 4 nM HCL indeholdende 0,1% BSA anvendt til TGF-β1-behandling og 0,05% DMSO til IPA-behandling, og begge blev anvendt sammen til kombinationsbehandlingen.
Apoptose blev vurderet ved hjælp af FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit med 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, katalognr. 640922) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev LX-2 (1 × 105 celler/brønd) dyrket natten over i plader med 12 brønde og derefter behandlet med flere doser IPA eller IPA og TGF-β1. Den følgende dag blev flydende og adhærente celler opsamlet, trypsiniseret, vasket med PBS, resuspenderet i Annexin V-bindingsbuffer og inkuberet med FITC-Annexin V og 7-AAD i 15 minutter.
Mitokondrier i levende celler blev farvet for oxidativ aktivitet ved hjælp af Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Til MTR-analyser blev LX-2-celler inkuberet ved lige tætheder med IPA og TGF-β1. Efter 24 timer blev levende celler trypsiniseret, vasket med PBS og derefter inkuberet med 100 μM MTR i serumfrit medium ved 37 °C i 20 minutter som tidligere beskrevet [26]. Til analyse af levende cellers morfologi blev cellestørrelse og cytoplasmisk kompleksitet analyseret ved hjælp af henholdsvis forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) parametre.
Alle data (30.000 hændelser) blev indsamlet ved hjælp af NovoCyte Quanteon (Agilent) og analyseret ved hjælp af NovoExpress® 1.4.1 eller FlowJo V.10 software.
Iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) blev målt i realtid ved hjælp af en Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) udstyret med en Seahorse XF Cell Mito Stress i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev 2 × 104 LX-2 celler/brønd podet på XF96 cellekulturplader. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med isopropanol (IPA) og TGF-β1 (Supplerende Metoder 1). Dataanalyse blev udført ved hjælp af Seahorse XF Wave-software, som inkluderer Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Ud fra dette blev et bioenergetisk sundhedsindeks (BHI) beregnet [27].
Total RNA blev transkriberet til cDNA. For specifikke metoder, se reference [15]. Human 60S ribosomalt surt protein P0 (RPLP0) og cyclophilin A1 (PPIA) mRNA-niveauer blev anvendt som konstitutive genkontroller. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Holland) blev anvendt sammen med TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) eller Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), og relativ genekspressionsfold blev beregnet ved hjælp af sammenlignende Ct-værdicyklusparametre (ΔΔCt) og ∆∆Ct-metoden. Detaljer om primerne findes i de supplerende tabeller S2 og S3.
Nukleært DNA (ncDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA) blev ekstraheret ved hjælp af DNeasy blod- og vævskittet (Qiagen) som tidligere beskrevet [28]. Den relative mængde mtDNA blev beregnet ved at beregne forholdet mellem hver mål-mtDNA-region og den geometriske middelværdi af de tre nukleære DNA-regioner (mtDNA/ncDNA), som beskrevet i Supplerende Metoder 2. Detaljer om primerne for mtDNA og ncDNA findes i Supplerende Tabel S4.
Levende celler blev farvet med Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) for at visualisere intercellulære og intracellulære mitokondrielle netværk. LX-2-celler (1 × 104 celler/brønd) blev dyrket på objektglas i tilsvarende kulturplader med glasbund (Ibidi GmbH, Martinsried, Tyskland). Efter 24 timer blev levende LX-2-celler inkuberet med 100 μM MTR i 20 minutter ved 37 °C, og cellekerner blev farvet med DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [29]. Mitokondrielle netværk blev visualiseret ved hjælp af et Zeiss Axio Observer inverteret mikroskop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland) udstyret med et Zeiss LSM 800 konfokalmodul ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2 ved hjælp af et 63×NA 1.3 objektiv. Vi erhvervede ti Z-seriebilleder for hver prøvetype. Hver Z-serie indeholder 30 sektioner, hver med en tykkelse på 9,86 μm. For hver prøve blev der taget billeder af ti forskellige synsfelter ved hjælp af ZEN 2009-software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland), og mitokondriemorfologianalyse blev udført ved hjælp af ImageJ-software (v1.54d) [30, 31] i henhold til de parametre, der er beskrevet i Supplerende Metoder 3.
Cellerne blev fikseret med 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, efterfulgt af fiksering med 1% osmiumtetroxidopløsning (Sigma Aldrich, MO, USA), gradvist dehydreret med acetone (Merck, Darmstadt, Tyskland) og endelig indlejret i epoxyharpiks. Ultratynde snit blev fremstillet og farvet med 1% uranylacetat (Merck, Darmstadt, Tyskland) og 1% blycitrat (Merck, Darmstadt, Tyskland). Ultrastrukturelle billeder blev opnået ved hjælp af et JEM 2100F EXII transmissionselektronmikroskop (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ved en accelerationsspænding på 80 kV.
Morfologien af ​​LX-2-celler behandlet med IPA i 24 timer blev analyseret ved fasekontrastmikroskopi ved 50x forstørrelse ved hjælp af et Zeiss inverteret lysmikroskop (Zeiss Axio Vert.A1 og AxioCam MRm, Jena, Tyskland).
Kliniske data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse eller median (interkvartilinterval: IQR). Envejs variansanalyse (kontinuerlige variabler) eller χ²-test (kategoriske variabler) blev brugt til at sammenligne forskellene mellem de tre studiegrupper. Den falsk positive rate (FDR) blev brugt til at korrigere for multiple tests, og gener med FDR < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Spearman-korrelationsanalyse blev brugt til at korrelere CpG-DNA-methylering med IPA-signalintensitet, med nominelle p-værdier (p < 0,05) rapporteret.
Leveranalyse blev udført ved hjælp af et webbaseret gensætanalyseværktøj (WebGestalt) for 268 transkripter (nominal p < 0,01), 119 mitokondrieassocierede transkripter (nominal p < 0,05) og 4350 CpG'er ud af 3093 levertranskripter, der var associeret med cirkulerende serum-IPA-niveauer. Det frit tilgængelige Venny DB (version 2.1.0)-værktøj blev brugt til at finde overlappende gener, og StringDB (version 11.5) blev brugt til at visualisere protein-protein-interaktioner.
For LX-2-eksperimentet blev prøverne testet for normalitet ved hjælp af D'Agostino-Pearson-testen. Data blev indhentet fra mindst tre biologiske replikater og underkastet envejs-ANOVA med Bonferroni post hoc-test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data præsenteres som middelværdi ± SD, og ​​antallet af eksperimenter er angivet i hver figur. Alle analyser og grafer blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 8 statistisk software til Windows (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, USA).
Først undersøgte vi sammenhængen mellem serum IPA-niveauer og lever-, helkrops- og mitokondrie-transkripter. I den samlede transkriptprofil var det stærkeste gen associeret med serum IPA-niveauer MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogen-aktiveret proteinkinase-aktiveret proteinkinase 3); i den mitokondrie-relaterede transkriptprofil var det stærkeste associerede gen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/threoninkinase 1) (Yderligere fil 1 og Yderligere fil 2).
Vi analyserede derefter globale transkripter (n = 268; p < 0,01) og mitokondrieassocierede transkripter (n = 119; p < 0,05), og identificerede i sidste ende apoptose som den mest betydningsfulde kanoniske signalvej (p = 0,0089). For mitokondrietranskripter associeret med serum IPA-niveauer fokuserede vi på apoptose (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029) og TNF-signalveje (FDR = 0,000006) (Figur 1A, Tabel 2 og Supplerende Figur 1A-B).
Overlappende analyse af globale, mitokondrieassocierede transkripter og DNA-methylering i human lever i forbindelse med serum IPA-niveauer. A repræsenterer 268 globale transkripter, 119 mitokondrieassocierede transkripter og DNA-methylerede transkripter, der er kortlagt til 3092 CpG-steder associeret med serum IPA-niveauer (p-værdier < 0,01 for globale transkripter og DNA-methyleret, og p-værdier < 0,05 for mitokondrietranskripter). De væsentligste overlappende transkripter er vist i midten (AKT1 og YKT6). B Interaktionskortet for de 13 gener med den højeste interaktionsscore (0,900) med andre gener blev konstrueret ud fra de 56 overlappende gener (sort linjeområde), der var signifikant associeret med serum IPA-niveauer ved hjælp af onlineværktøjet StringDB. Grøn: Gener kortlagt til Gene Ontology (GO) cellulære komponent: mitokondrier (GO:0005739). AKT1 er proteinet med den højeste score (0,900) for interaktioner med andre proteiner baseret på dataene (baseret på tekstmining, eksperimenter, databaser og co-ekspression). Netværksknuder repræsenterer proteiner, og kanter repræsenterer forbindelser mellem proteiner.
Da metabolitter i tarmmikrobiota kan regulere epigenetisk sammensætning gennem DNA-methylering [32], undersøgte vi, om serum-IPA-niveauer var forbundet med lever-DNA-methylering. Vi fandt, at de to vigtigste methyleringssteder forbundet med serum-IPA-niveauer var nær prolin-serin-rig region 3 (C19orf55) og varmechokproteinfamilie B (lille) medlem 6 (HSPB6) (Yderligere fil 3). DNA-methylering af 4350 CpG (p < 0,01) var korreleret med serum-IPA-niveauer og var beriget med reguleringsveje for levetid (p = 0,006) (Figur 1A, Tabel 2 og Supplerende Figur 1C).
For at forstå de biologiske mekanismer, der ligger til grund for sammenhængene mellem serum IPA-niveauer, globale transkripter, mitokondrieassocierede transkripter og DNA-methylering i den menneskelige lever, udførte vi en overlapningsanalyse af de gener, der blev identificeret i den foregående signalvejsanalyse (Figur 1A). Resultaterne af signalvejsberigelsesanalysen af ​​de 56 overlappende gener (inden for den sorte linje i Figur 1A) viste, at apoptose-signalvejen (p = 0,00029) fremhævede to gener, der er fælles for de tre analyser: AKT1 og YKT6 (YKT6 v-SNARE-homolog), som vist i Venn-diagrammet (Supplerende Figur 2 og Figur 1A). Interessant nok fandt vi, at AKT1 (cg19831386) og YKT6 (cg24161647) var positivt korreleret med serum IPA-niveauer (Yderligere fil 3). For at identificere potentielle proteininteraktioner mellem genprodukter valgte vi 13 gener med den højeste fælles regionscore (0,900) blandt 56 overlappende gener som input og konstruerede et interaktionskort. Ifølge konfidensniveauet (marginal konfidens) var AKT1-genet med den højeste score (0,900) øverst (figur 1B).
Baseret på signalvejsanalysen fandt vi, at apoptose var den primære signalvej, så vi undersøgte, om IPA-behandling ville påvirke apoptose af HSC'er in vitro. Vi har tidligere vist, at forskellige doser af IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM) var ikke-toksiske for LX-2-celler [15]. Dette studie viste, at IPA-behandling ved 10 μM og 100 μM øgede antallet af levedygtige og nekrotiske celler. Sammenlignet med kontrolgruppen faldt cellelevedygtigheden dog ved en koncentration på 1 mM IPA, mens cellenekroseraten forblev uændret (Figur 2A, B). For at finde den optimale koncentration til at inducere apoptose i LX-2-celler testede vi derefter 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer (Figur 2A-E og Supplerende Figur 3A-B). Interessant nok reducerede IPA 10 μM og 100 μM apoptoseraten (%), men IPA 1 mM øgede sen apoptose og apoptoseraten (%) sammenlignet med kontrolgruppen og blev derfor valgt til yderligere eksperimenter (figur 2A-D).
IPA inducerer apoptose af LX-2-celler. Annexin V og 7-AAD dobbeltfarvningsmetoden blev anvendt til at kvantificere apoptosehastigheden og cellemorfologien ved hjælp af flowcytometri. BA-celler blev inkuberet med 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer eller med F-H TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfrit medium i 24 timer. A: levende celler (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotiske celler (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: tidlig (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: sen (Annexin V+/7AAD.+); E, H: procentdel af samlede tidlige og sene apoptotiske celler i apoptosehastighed (%). Data udtrykkes som middelværdi ± SD, n = 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af envejs ANOVA med Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Som vi tidligere har vist, kan 5 ng/ml TGF-β1 inducere HSC-aktivering ved at øge ekspressionen af ​​klassiske markørgener [15]. LX-2-celler blev behandlet med 5 ng/ml TGF-β1 og 1 mM IPA i kombination (fig. 2E-H). TGF-β1-behandling ændrede ikke apoptosehastigheden, men IPA-samtidig behandling øgede sen apoptose og apoptosehastighed (%) sammenlignet med TGF-β1-behandling (fig. 2E-H). Disse resultater indikerer, at 1 mM IPA kan fremme apoptose i LX-2-celler uafhængigt af TGF-β1-induktion.
Vi undersøgte yderligere effekten af ​​IPA på mitokondriel respiration i LX-2-celler. Resultaterne viste, at 1 mM IPA reducerede parametrene for iltforbrugshastigheden (OCR): ikke-mitokondriel respiration, basal og maksimal respiration, protonlækage og ATP-produktion sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 3A, B), mens det bioenergetiske sundhedsindeks (BHI) ikke ændrede sig.
IPA reducerer mitokondriel respiration i LX-2-celler. Den mitokondrielle respirationskurve (OCR) præsenteres som mitokondrielle respirationsparametre (ikke-mitokondriel respiration, basal respiration, maksimal respiration, protonlækage, ATP-generering, SRC og BHI). Cellerne A og B blev inkuberet med henholdsvis 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer. Cellerne C og D blev inkuberet med henholdsvis TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfrit medium i 24 timer. Alle målinger blev normaliseret til DNA-indhold ved hjælp af CyQuant-kittet. BHI: bioenergetisk sundhedsindeks; SRC: respiratorisk reservekapacitet; OCR: iltforbrugshastighed. Data præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse (SD), n = 5 uafhængige eksperimenter. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af envejs ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; og ***p < 0,001
For at få en mere omfattende forståelse af effekten af ​​IPA på den bioenergetiske profil af TGF-β1-aktiverede LX-2-celler, analyserede vi mitokondriel oxidativ fosforylering ved OCR (fig. 3C, D). Resultaterne viste, at TGF-β1-behandling kunne reducere den maksimale respiration, respiratoriske reservekapacitet (SRC) og BHI sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3C, D). Derudover reducerede kombinationsbehandlingen basal respiration, protonlækage og ATP-produktion, men SRC og BHI var signifikant højere end dem, der blev behandlet med TGF-β1 (fig. 3C, D).
Vi udførte også "Cellular Energy Phenotype Test" leveret af Seahorse-software (Supplerende Fig. 4A-D). Som vist i Supplerende Fig. 3B, var både OCR- og ECAR-metaboliske potentialer faldet efter TGF-β1-behandling, men der blev ikke observeret nogen forskel i kombinations- og IPA-behandlingsgrupperne sammenlignet med kontrolgruppen. Desuden var både basale og stressniveauer af OCR faldet efter kombinations- og IPA-behandling sammenlignet med kontrolgruppen (Supplerende Fig. 4C). Interessant nok blev et lignende mønster observeret med kombinationsbehandling, hvor der ikke blev observeret nogen ændring i basale og stressniveauer af ECAR sammenlignet med TGF-β1-behandling (Supplerende Fig. 4C). I HSC'er ændrede reduktionen i mitokondriel oxidativ fosforylering og kombinationsbehandlingens evne til at genoprette SCR og BHI efter eksponering for TGF-β1-behandling ikke det metaboliske potentiale (OCR og ECAR). Samlet set indikerer disse resultater, at IPA kan reducere bioenergetikken i HSC'er, hvilket tyder på, at IPA kan inducere en lavere energiprofil, der forskyder HSC-fænotypen mod inaktivering (Supplerende Figur 4D).
Effekten af ​​IPA på mitokondriedynamik blev undersøgt ved hjælp af tredimensionel kvantificering af mitokondriemorfologi og netværksforbindelser samt MTR-farvning (Figur 4 og Supplerende Figur 5). Figur 4 viser, at TGF-β1-behandling, sammenlignet med kontrolgruppen, reducerede det gennemsnitlige overfladeareal, antallet af grene, den samlede grenlængde og antallet af grenforbindelser (Figur 4A og B) og ændrede andelen af ​​mitokondrier fra sfærisk til intermediær morfologi (Figur 4C). Kun IPA-behandling reducerede det gennemsnitlige mitokondrievolumen og ændrede andelen af ​​mitokondrier fra sfærisk til intermediær morfologi sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 4A). I ​​modsætning hertil forblev sfæricitet, gennemsnitlig grenlængde og mitokondrieaktivitet vurderet ved mitokondriemembranpotentialafhængig MTR (Figur 4A og E) uændret, og disse parametre adskilte sig ikke mellem grupperne. Samlet set tyder disse resultater på, at TGF-β1- og IPA-behandling synes at modulere mitokondrieform og -størrelse samt netværkskompleksitet i levende LX-2-celler.
IPA ændrer mitokondriedynamik og mitokondrie-DNA-forekomst i LX-2-celler. A. Repræsentative konfokale billeder af levende LX-2-celler inkuberet med TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i 24 timer i serumfrit medium, der viser mitokondrie-netværk farvet med Mitotracker™ Red CMXRos og kerner farvet blå med DAPI. Alle data indeholdt mindst 15 billeder pr. gruppe. Vi erhvervede 10 Z-stack-billeder for hver prøvetype. Hver Z-aksesekvens indeholdt 30 skiver, hver med en tykkelse på 9,86 μm. Skalalinje: 10 μm. B. Repræsentative objekter (kun mitokondrier) identificeret ved at anvende adaptiv tærskelværdi på billedet. Kvantitativ analyse og sammenligning af mitokondrie-morfologiske netværksforbindelser blev udført for alle celler i hver gruppe. C. Hyppighed af mitokondrieformforhold. Værdier tæt på 0 angiver sfæriske former, og værdier tæt på 1 angiver filamentøse former. D Mitokondrie-DNA (mtDNA) indhold blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. E Mitotracker™ Red CMXRos-analyse blev udført ved hjælp af flowcytometri (30.000 hændelser) som beskrevet i Materialer og Metoder. Data præsenteres som middelværdi ± SD, n = 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af envejs-ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Vi analyserede derefter mtDNA-indholdet i LX-2-celler som en indikator for mitokondrieantallet. Sammenlignet med kontrolgruppen var mtDNA-indholdet forhøjet i den TGF-β1-behandlede gruppe (Figur 4D). Sammenlignet med den TGF-β1-behandlede gruppe var mtDNA-indholdet reduceret i kombinationsbehandlingsgruppen (Figur 4D), hvilket tyder på, at IPA kan reducere mtDNA-indholdet og muligvis mitokondrieantallet samt mitokondrierespiration (Figur 3C). Desuden syntes IPA at reducere mtDNA-indholdet i kombinationsbehandlingen, men påvirkede ikke MTR-medieret mitokondrieaktivitet (Figur 4A-C).
Vi undersøgte sammenhængen mellem IPA og mRNA-niveauerne af gener forbundet med fibrose, apoptose, overlevelse og mitokondriedynamik i LX-2-celler (Figur 5A-D). Sammenlignet med kontrolgruppen viste den TGF-β1-behandlede gruppe øget ekspression af gener såsom kollagen type I α2-kæde (COL1A2), α-glatmuskelaktin (αSMA), matrixmetalloproteinase 2 (MMP2), vævshæmmer af metalloproteinase 1 (TIMP1) og dynamin 1-lignende gen (DRP1), hvilket indikerer øget fibrose og aktivering. Ydermere reducerede TGF-β1-behandlingen, sammenlignet med kontrolgruppen, mRNA-niveauerne af nuklear pregnan X-receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, hæmmer af B-celle α, enhancer af nuklear faktor κ-genets lyspeptid (NFκB1A) og hæmmer af nuklear faktor κB-kinase-subunit β (IKBKB) (Figur 5A-D). Sammenlignet med TGF-β1-behandling reducerede kombinationsbehandling med TGF-β1 og IPA ekspressionen af ​​COL1A2 og MMP2, men øgede mRNA-niveauerne af PXR, TIMP1, B-celle lymfom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β og IKBKB. IPA-behandling reducerede signifikant ekspressionen af ​​MMP2, Bcl-2-associeret protein X (BAX), AKT1, optisk atrofiprotein 1 (OPA1) og mitokondriefusionsprotein 2 (MFN2), hvorimod ekspressionen af ​​CASP8, NFκB1A, NFκB1B og IKBKB var forhøjet sammenlignet med kontrolgruppen. Der blev dog ikke fundet nogen forskel i ekspressionen af ​​caspase-3 (CASP3), apoptotisk peptidaseaktiverende faktor 1 (APAF1), mitokondriefusionsprotein 1 (MFN1) og fissionsprotein 1 (FIS1). Samlet set tyder disse resultater på, at IPA-behandling modulerer ekspressionen af ​​gener forbundet med fibrose, apoptose, overlevelse og mitokondriedynamik. Vores data tyder på, at IPA-behandling reducerer fibrose i LX-2-celler; samtidig stimulerer den overlevelse ved at ændre fænotypen mod inaktivering.
IPA modulerer ekspressionen af ​​fibroblast-, apoptotiske, levedygtigheds- og mitokondriedynamikgener i LX-2-celler. Histogrammer viser mRNA-ekspression i forhold til endogen kontrol (RPLP0 eller PPIA) efter at LX-2-celler blev induceret med TGF-β1 og IPA i serumfrit medium i 24 timer. A angiver fibroblaster, B angiver apoptotiske celler, C angiver overlevende celler, og D angiver mitokondriedynamikgenekspression. Data præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse (SD), n = 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af envejs ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Derefter blev ændringer i cellestørrelse (FSC-H) og cytoplasmisk kompleksitet (SSC-H) vurderet ved flowcytometri (Figur 6A, B), og ændringer i cellemorfologi efter IPA-behandling blev vurderet ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) og fasekontrastmikroskopi (Supplerende Figur 6A-B). Som forventet steg cellerne i den TGF-β1-behandlede gruppe i størrelse sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 6A, B), hvilket viser den klassiske ekspansion af det ru endoplasmatisk reticulum (ER*) og fagolysosomer (P), hvilket indikerer aktivering af hæmatopoietiske stamceller (HSC) (Supplerende Figur 6A). Sammenlignet med den TGF-β1-behandlede gruppe var cellestørrelsen, den cytoplasmiske kompleksitet (Fig. 6A, B) og ER*-indholdet dog reduceret i TGF-β1- og IPA-kombinationsbehandlingsgruppen (Supplerende Figur 6A). Ydermere reducerede IPA-behandling cellestørrelsen, den cytoplasmiske kompleksitet (Fig. 6A, B), P- og ER*-indholdet (Supplerende Figur 6A) sammenlignet med kontrolgruppen. Derudover steg indholdet af apoptotiske celler efter 24 timers IPA-behandling sammenlignet med kontrolgruppen (hvide pile, supplerende figur 6B). Samlet set tyder disse resultater på, at 1 mM IPA kan stimulere HSC-apoptose og reversere ændringerne i cellemorfologiske parametre induceret af TGF-β1 og derved regulere cellestørrelsen og kompleksiteten, hvilket kan være forbundet med HSC-inaktivering.
IPA ændrer cellestørrelse og cytoplasmisk kompleksitet i LX-2-celler. Repræsentative billeder af flowcytometrianalyse. Analysen anvendte en gatingstrategi specifik for LX-2-celler: SSC-A/FSC-A til at definere cellepopulationen, FSC-H/FSC-A til at identificere dubletter og SSC-H/FSC-H til cellestørrelses- og kompleksitetsanalyse. Celler blev inkuberet med TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfrit medium i 24 timer. LX-2-celler blev fordelt i nederste venstre kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), øverste venstre kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), nederste højre kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) og øverste højre kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) til cellestørrelses- og cytoplasmisk kompleksitetsanalyse. B. Cellemorfologi blev analyseret ved flowcytometri ved hjælp af FSC-H (forward scatter, cellestørrelse) og SSC-H (sidespredning, cytoplasmisk kompleksitet) (30.000 hændelser). Data præsenteres som middelværdi ± SD, n = 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af envejs ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 og ****p < 0,0001
Tarmmetabolitter som IPA er blevet et varmt emne inden for forskning, hvilket tyder på, at nye mål kan blive opdaget i tarmmikrobiotaen. Det er derfor interessant, at IPA, en metabolit, som vi har forbundet med leverfibrose hos mennesker [15], har vist sig at være en potentiel antifibrotisk forbindelse i dyremodeller [13, 14]. Her demonstrerer vi for første gang en sammenhæng mellem serum-IPA og global levertranskriptomik og DNA-methylering hos overvægtige individer uden type 2-diabetes (T2D), hvilket fremhæver apoptose, mitofagi og levetid, samt et muligt kandidatgen AKT1, der regulerer leverhomeostase. En anden nyhed i vores undersøgelse er, at vi demonstrerede interaktionen mellem IPA-behandling og apoptose, cellemorfologi, mitokondriel bioenergetik og dynamik i LX-2-celler, hvilket indikerer et lavere energispektrum, der forskyder HSC-fænotypen mod inaktivering, hvilket gør IPA til en potentiel kandidat til forbedring af leverfibrose.
Vi fandt, at apoptose, mitofagi og levetid var de vigtigste kanoniske veje beriget med levergener forbundet med cirkulerende serum IPA. Forstyrrelse af mitokondriekvalitetskontrolsystemet (MQC) kan føre til mitokondriel dysfunktion, mitofagi og apoptose, hvorved forekomsten af ​​MASLD fremmes [33, 34]. Derfor kan vi spekulere i, at IPA kan være involveret i at opretholde celledynamik og mitokondrieintegritet gennem apoptose, mitofagi og levetid i leveren. Vores data viste, at to gener var fælles på tværs af de tre assays: YKT6 og AKT1. Det er værd at bemærke, at YKT6 er et SNARE-protein involveret i processen med cellemembranfusion. Det spiller en rolle i autofagi og mitofagi ved at danne et initieringskompleks med STX17 og SNAP29 på autofagosomet, hvorved fusionen af ​​autofagosomer og lysosomer fremmes [35]. Derudover resulterer tab af YKT6-funktion i forringet mitofagi [36], mens opregulering af YKT6 er forbundet med progressionen af ​​hepatocellulært carcinom (HCC), hvilket viser øget celleoverlevelse [37]. På den anden side er AKT1 det vigtigste interagerende gen og spiller en vigtig rolle i leversygdomme, herunder PI3K/AKT-signalvejen, cellecyklus, cellemigration, proliferation, fokal adhæsion, mitokondriefunktion og kollagensekretion [38-40]. Aktiveret PI3K/AKT-signalvej kan aktivere hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), som er de celler, der er ansvarlige for produktionen af ​​ekstracellulær matrix (ECM), og dens dysregulering kan bidrage til forekomsten og progressionen af ​​leverfibrose [40]. Derudover er AKT en af ​​de vigtigste celleoverlevelsesfaktorer, der hæmmer p53-afhængig celleapoptose, og AKT-aktivering kan være forbundet med hæmningen af ​​levercelleapoptose [41, 42]. De opnåede resultater tyder på, at IPA kan være involveret i levermitokondrierassocieret apoptose ved at påvirke hepatocytters beslutning om at gå ind i apoptose eller overlevelse. Disse effekter kan være reguleret af AKT- og/eller YKT6-kandidatgener, som er kritiske for leverhomeostase.
Vores resultater viste, at 1 mM IPA inducerede apoptose og mindskede mitokondriel respiration i LX-2-celler uafhængigt af TGF-β1-behandling. Det er bemærkelsesværdigt, at apoptose er en vigtig vej for fibroseopløsning og aktivering af hæmatopoietiske stamceller (HSC), og også en nøglebegivenhed i den reversible fysiologiske respons på leverfibrose [4, 43]. Desuden gav genoprettelsen af ​​BHI i LX-2-celler efter kombinationsbehandling ny indsigt i IPAs potentielle rolle i reguleringen af ​​mitokondriel bioenergetik. Under hvile- og inaktive forhold anvender hæmatopoietiske celler normalt mitokondriel oxidativ fosforylering til at producere ATP og har lav metabolisk aktivitet. På den anden side forbedrer HSC-aktivering mitokondriel respiration og biosyntese for at kompensere for energibehovet ved at gå ind i den glykolytiske tilstand [44]. Det faktum, at IPA ikke påvirkede metabolisk potentiale og ECAR, antyder, at den glykolytiske vej er mindre prioriteret. Tilsvarende viste et andet studie, at 1 mM IPA var i stand til at modulere mitokondriel respirationskædeaktivitet i kardiomyocytter, human hepatocytcellelinje (Huh7) og humane navleveneendotelceller (HUVEC); Der blev imidlertid ikke fundet nogen effekt af IPA på glykolyse i kardiomyocytter, hvilket tyder på, at IPA kan påvirke bioenergetikken i andre celletyper [45]. Derfor spekulerer vi i, at 1 mM IPA kan virke som en mild kemisk afkobler, da det kan reducere fibrogen genekspression, cellemorfologi og mitokondriel bioenergetik betydeligt uden at ændre mængden af ​​mtDNA [46]. Mitokondrielle afkoblere kan hæmme kulturinduceret fibrose og HSC-aktivering [47] og reducere mitokondriel ATP-produktion reguleret eller induceret af visse proteiner såsom afkoblingsproteiner (UCP) eller adeninnukleotidtranslokase (ANT). Afhængigt af celletypen kan dette fænomen beskytte celler mod apoptose og/eller fremme apoptose [46]. Yderligere undersøgelser er dog nødvendige for at belyse IPAs rolle som en mitokondriel afkobler i hæmatopoietisk stamcelleinaktivering.
Vi undersøgte derefter, om ændringerne i mitokondrie-respiration afspejles i mitokondrie-morfologien i levende LX-2-celler. Interessant nok ændrer TGF-β1-behandling mitokondrieforholdet fra sfærisk til intermediært, med nedsat mitokondrie-forgrening og øget ekspression af DRP1, en nøglefaktor i mitokondrie-fission [48]. Desuden er mitokondrie-fragmentering forbundet med den samlede netværkskompleksitet, og overgangen fra fusion til fission er kritisk for aktivering af hæmatopoietiske stamceller (HSC), hvorimod hæmning af mitokondrie-fission fører til HSC-apoptose [49]. Vores resultater indikerer således, at TGF-β1-behandling kan inducere et fald i mitokondrie-netværkskompleksitet med nedsat forgrening, hvilket er mere almindeligt i mitokondrie-fission forbundet med aktiverede hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Desuden viste vores data, at IPA kunne ændre andelen af ​​mitokondrier fra sfærisk til intermediær form og derved reducere ekspressionen af ​​OPA1 og MFN2. Studier har vist, at nedregulering af OPA1 kan forårsage et fald i mitokondrie-membranpotentialet og udløse celle-apoptose [50]. MFN2 er kendt for at mediere mitokondrie-fusion og apoptose [51]. De opnåede resultater tyder på, at induktion af LX-2-celler af TGF-β1 og/eller IPA synes at modulere mitokondrieform og -størrelse, såvel som aktiveringstilstand og netværkskompleksitet.
Vores resultater indikerer, at kombinationsbehandlingen af ​​TGFβ-1 og IPA kan reducere mtDNA og cellemorfologiske parametre ved at regulere mRNA-ekspressionen af ​​fibrose, apoptose og overlevelsesrelaterede gener i apoptose-undvigende celler. IPA reducerede faktisk mRNA-ekspressionsniveauet af AKT1 og vigtige fibrosegener såsom COL1A2 og MMP2, men øgede ekspressionsniveauet af CASP8, som er forbundet med apoptose. Vores resultater viste, at efter IPA-behandling faldt BAX-ekspressionen, og mRNA-ekspressionen af ​​TIMP1-familiens underenheder, BCL-2 og NF-κB steg, hvilket tyder på, at IPA kan stimulere overlevelsessignaler i hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), der undgår apoptose. Disse molekyler kan fungere som pro-overlevelsessignaler i aktiverede hæmatopoietiske stamceller, hvilket kan være forbundet med øget ekspression af anti-apoptotiske proteiner (såsom Bcl-2), nedsat ekspression af pro-apoptotisk BAX og et komplekst samspil mellem TIMP og NF-κB [5, 7]. IPA udøver sin effekt gennem PXR, og vi fandt, at kombinationsbehandling med TGF-β1 og IPA øgede PXR mRNA-ekspressionsniveauer, hvilket indikerer undertrykkelse af HSC-aktivering. Aktiveret PXR-signalering er kendt for at hæmme HSC-aktivering både in vivo og in vitro [52, 53]. Vores resultater indikerer, at IPA kan deltage i clearance af aktiverede HSC'er ved at fremme apoptose, reducere fibrose og mitokondriemetabolisme og forbedre overlevelsessignaler, som er typiske processer, der omdanner den aktiverede HSC-fænotype til en inaktiveret. En anden mulig forklaring på den potentielle mekanisme og rolle af IPA i apoptose er, at den primært opfanger dysfunktionelle mitokondrier gennem mitofagi (intrinsisk signalvej) og den ekstrinsiske TNF-signalvej (Tabel 1), som er direkte forbundet med NF-κB-overlevelsessignalvejen (Supplerende Figur 7). Interessant nok er IPA-relaterede berigede gener i stand til at inducere pro-apoptotiske og pro-overlevelsessignaler i den apoptotiske vej [54], hvilket antyder, at IPA kan inducere den apoptotiske vej eller overlevelse ved at interagere med disse gener. Det er imidlertid fortsat uklart, hvordan IPA inducerer apoptose eller overlevelse under HSC-aktivering og dens mekanistiske veje.
IPA er en mikrobiel metabolit, der dannes fra tryptofan i kosten via tarmfloraen. Studier har vist, at det har antiinflammatoriske, antioxidante og epigenetiske regulatoriske egenskaber i tarmmiljøet.[55] Studier har vist, at IPA kan modulere tarmbarrierefunktionen og reducere oxidativ stress, hvilket kan bidrage til dets lokale fysiologiske virkninger.[56] Faktisk transporteres IPA til målorganer via kredsløbet, og da IPA deler en lignende hovedmetabolitstruktur med tryptofan, serotonin og indolderivater, udøver IPA metaboliske virkninger, hvilket resulterer i konkurrerende metaboliske skæbner.[52] IPA kan konkurrere med tryptofan-afledte metabolitter om bindingssteder på enzymer eller receptorer, hvilket potentielt forstyrrer normale metaboliske veje. Dette understreger behovet for yderligere undersøgelser af dets farmakokinetik og farmakodynamik for bedre at forstå dets terapeutiske vindue.[57] Det er endnu uvist, om dette også kan forekomme i hæmatopoietiske stamceller (HSC'er).
Vi anerkender, at vores undersøgelse har nogle begrænsninger. For specifikt at undersøge sammenhænge relateret til IPA, ekskluderede vi patienter med type 2-diabetes mellitus (T2DM). Vi anerkender, at dette begrænser den brede anvendelighed af vores resultater på patienter med type 2-diabetes mellitus og fremskreden leversygdom. Selvom den fysiologiske koncentration af IPA i humant serum er 1-10 μM [11, 20], blev en koncentration på 1 mM IPA valgt baseret på den højeste ikke-toksiske koncentration [15] og den højeste apoptoserate, uden forskel i procentdelen af ​​den nekrotiske cellepopulation. Selvom suprafysiologiske niveauer af IPA blev anvendt i denne undersøgelse, er der i øjeblikket ingen konsensus om den effektive dosis af IPA [52]. Selvom vores resultater er signifikante, forbliver den bredere metaboliske skæbne af IPA et aktivt forskningsområde. Desuden blev vores resultater om sammenhængen mellem serum-IPA-niveauer og DNA-methylering af levertranskripter ikke kun opnået fra hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), men også fra levervæv. Vi valgte at bruge humane LX-2-celler baseret på vores tidligere fund fra transkriptomanalyse, der viser, at IPA er forbundet med aktivering af hæmatopoietiske stamceller (HSC) [15], og at HSC'er er de vigtigste celler involveret i progressionen af ​​leverfibrose. Leveren er sammensat af flere celletyper, så andre cellemodeller, såsom hepatocyt-HSC-immuncelle-co-kultursystem kombineret med caspase-aktivering og DNA-fragmentering samt virkningsmekanismen, herunder proteinniveau, bør overvejes for at studere IPA's rolle og dens interaktion med andre levercelletyper.