Forskellige planteforsvarsteorier giver vigtig teoretisk vejledning til at forklare mønstrene i planters specialiserede metabolisme, men deres vigtigste forudsigelser mangler stadig at blive testet. Her brugte vi objektiv tandem-massespektrometri (MS/MS) analyse til systematisk at undersøge metabolomet af tobakssvækkede stammer fra individuelle planter til populationer og nært beslægtede arter og bearbejdede et stort antal massespektrometriske trækteorier baseret på sammensatte spektre i informationsrammen til at teste de vigtigste forudsigelser for optimalt forsvar (OD) og bevægelige mål (MT) teorier. Informationskomponenten i plantemetabolomik er i overensstemmelse med OD-teorien, men modsiger den primære forudsigelse i MT-teorien om metabolomikdynamik forårsaget af planteædere. Fra mikro- til makroevolutionær skala blev jasmonatsignalet identificeret som den vigtigste determinant for OD, mens ethylensignalet leverede finjustering af det planteæderspecifikke respons annoteret af MS/MS-molekylærnetværket.
Specielle metabolitter med forskellige strukturer er de vigtigste deltagere i planters tilpasning til miljøet, især i forsvaret mod fjender (1). Den forbløffende diversificering af den specielle metabolisme, der findes i planter, har stimuleret årtiers dybdegående forskning i dens mange aspekter af økologiske funktioner og har dannet en lang liste af planteforsvarsteorier, som er den evolutionære og økologiske udvikling af plante-insekt-interaktioner. Empirisk forskning giver vigtig vejledning (2). Disse planteforsvarsteorier fulgte dog ikke den normative vej med hypotetisk deduktiv ræsonnement, hvor nøgleforudsigelser var på samme analyseniveau (3) og blev testet eksperimentelt for at fremme den næste cyklus af teoretisk udvikling (4). Tekniske begrænsninger begrænser dataindsamling til specifikke metaboliske kategorier og udelukker omfattende analyse af specialiserede metabolitter, hvilket forhindrer sammenligninger mellem kategorier, der er afgørende for teoretisk udvikling (5). Manglen på omfattende metabolomiske data og en fælles valuta til at sammenligne behandlingsarbejdsgangen i det metaboliske rum mellem forskellige plantegrupper hæmmer feltets videnskabelige modenhed.
Den seneste udvikling inden for tandem massespektrometri (MS/MS) metabolomik kan omfattende karakterisere de metaboliske ændringer inden for og mellem arter i en given systemklade og kan kombineres med beregningsmetoder til at beregne den strukturelle lighed mellem disse komplekse blandinger. Forudgående kendskab til kemi (5). Kombinationen af ​​avancerede teknologier inden for analyse og databehandling giver en nødvendig ramme for langsigtet testning af mange forudsigelser foretaget af de økologiske og evolutionære teorier om metabolisk diversitet. Shannon (6) introducerede informationsteori for første gang i sin skelsættende artikel i 1948 og lagde dermed grundlaget for den matematiske analyse af information, som er blevet brugt på mange andre områder end dens oprindelige anvendelse. Inden for genomik er informationsteori med succes blevet anvendt til at kvantificere sekvenskonservativ information (7). Inden for transkriptomikforskning analyserer informationsteori de samlede ændringer i transkriptomet (8). I tidligere forskning anvendte vi den statistiske ramme for informationsteori på metabolomik for at beskrive den metaboliske ekspertise på vævsniveau i planter (9). Her kombinerer vi den MS/MS-baserede arbejdsgang med informationsteoriens statistiske ramme, karakteriseret ved den metaboliske diversitet i den fælles valuta, for at sammenligne de vigtigste forudsigelser fra planteforsvarsteorien om metabolomet induceret af planteædere.
De teoretiske rammer for planteforsvar er normalt gensidigt inkluderende og kan opdeles i to kategorier: dem, der forsøger at forklare fordelingen af ​​plantespecifikke metabolitter baseret på forsvarsfunktioner, såsom optimalt forsvar (OD) (10), bevægeligt mål (MT) (11) og udseendesteori (12), mens andre søger mekaniske forklaringer på, hvordan ændringer i ressourcetilgængelighed påvirker plantevækst og akkumuleringen af ​​specialiserede metabolitter, såsom kulstof: næringsstofbalancehypotesen (13), vækstratehypotesen (14) og vækst- og differentieringsligevægtshypotesen (15). De to sæt teorier er på forskellige analyseniveauer (4). Imidlertid dominerer to teorier, der involverer defensive funktioner på det funktionelle niveau, samtalen om planters konstitutive og inducerbare forsvar: OD-teorien, som antager, at planter kun investerer i deres dyre kemiske forsvar, når det er nødvendigt, for eksempel når de indtages. Når et græsdyr angriber, tildeles derfor, i henhold til muligheden for fremtidigt angreb, forbindelsen med en defensiv funktion (10); MT-hypotesen foreslår, at der ikke er nogen akse for retningsbestemt metabolitændring, men at metabolitten ændrer sig tilfældigt, hvilket skaber muligheden for at obstruere det metaboliske "bevægelsesmål" for angribende planteædere. Med andre ord fremsætter disse to teorier modsatte forudsigelser om den metaboliske ombygning, der sker efter et angreb fra planteædere: forholdet mellem den ensrettede akkumulering af metabolitter med defensiv funktion (OD) og ikke-retningsbestemte metaboliske ændringer (MT) (11).
OD- og MT-hypoteserne involverer ikke kun de inducerede ændringer i metabolomet, men også de økologiske og evolutionære konsekvenser af akkumuleringen af ​​disse metabolitter, såsom de adaptive omkostninger og fordele ved disse metaboliske ændringer i et specifikt økologisk miljø (16). Selvom begge hypoteser anerkender den defensive funktion af specialiserede metabolitter, som kan være dyre eller ej, ligger den vigtigste forudsigelse, der adskiller OD- og MT-hypoteserne, i retningen af ​​de inducerede metaboliske ændringer. Forudsigelsen af ​​OD-teorien har hidtil fået den mest eksperimentelle opmærksomhed. Disse tests inkluderer studiet af de direkte eller indirekte forsvarsfunktioner i forskellige væv af specifikke forbindelser i drivhuse og naturlige forhold, samt ændringer i plantens udviklingsstadium (17-19). På grund af manglen på en arbejdsgang og statistisk ramme for global omfattende analyse af metabolisk diversitet hos enhver organisme, er den største forskel i forudsigelsen mellem de to teorier (dvs. retningen af ​​metaboliske ændringer) dog stadig ikke testet. Her giver vi en sådan analyse.
En af de mest betydningsfulde karakteristika ved plantespecifikke metabolitter er deres ekstreme strukturelle diversitet på alle niveauer fra enkelte planter og populationer til lignende arter (20). Mange kvantitative ændringer i specialiserede metabolitter kan observeres på populationsniveau, mens stærke kvalitative forskelle normalt opretholdes på artsniveau (20). Derfor er plantemetabolisk diversitet det vigtigste aspekt af funktionel diversitet, hvilket afspejler tilpasningsevnen til forskellige nicher, især de nicher med forskellige invasionsmuligheder fra specielle insekter og almindelige planteædere (21). Siden Fraenkels (22) banebrydende artikel om årsagerne til eksistensen af ​​plantespecifikke metabolitter er interaktioner med forskellige insekter blevet betragtet som vigtige selektionstryk, og disse interaktioner menes at have formet planter under evolutionen. Metabolisk vej (23). Interartsforskelle i diversiteten af ​​specialiserede metabolitter kan også afspejle den fysiologiske balance forbundet med konstitutivt og inducerbart planteforsvar mod planteædende strategier, da de to arter ofte er negativt korreleret med hinanden (24). Selvom det kan være gavnligt at opretholde et godt forsvar til enhver tid, giver rettidige metaboliske ændringer forbundet med forsvar klare fordele ved at give planter mulighed for at allokere værdifulde ressourcer til andre fysiologiske investeringer (19, 24) og undgå behovet for symbiose. Følgeskader (25). Derudover kan disse reorganiseringer af specialiserede metabolitter forårsaget af insektherbivorer føre til destruktiv fordeling i populationen (26) og kan afspejle direkte aflæsninger af væsentlige naturlige ændringer i jasmonsyre (JA)-signalet, som kan opretholdes i populationen. Høje og lave JA-signaler er afvejninger mellem forsvar mod herbivorer og konkurrence med specifikke arter (27). Derudover vil specialiserede metabolitbiosynteseveje undergå hurtigt tab og transformation under evolutionen, hvilket resulterer i ujævn metabolisk fordeling blandt nært beslægtede arter (28). Disse polymorfier kan hurtigt etableres som reaktion på skiftende herbivormønstre (29), hvilket betyder, at udsvingene i herbivorsamfund er en nøglefaktor, der driver metabolisk heterogenitet.
Her har vi specifikt løst følgende problemer. (I) Hvordan omkonfigurerer det planteædende insekt plantemetabolomet? (Ii) Hvad er de vigtigste informationskomponenter i metabolisk plasticitet, der kan kvantificeres for at teste forudsigelserne i langsigtet forsvarsteori? (Iii) Hvorvidt plantemetabolomet skal omprogrammeres på en måde, der er unik for angriberen, og i så fald hvilken rolle spiller plantehormon i at skræddersy et specifikt metabolisk respons, og hvilke metabolitter bidrager til forsvarets artsspecificitet? (Iv) Da forudsigelserne fra mange forsvarsteorier kan udvides til alle niveauer af biologisk væv, spurgte vi, hvor konsistent det forårsagede metaboliske respons er fra intern sammenligning til sammenligning mellem arter? Til dette formål har vi systematisk undersøgt bladmetabolomet af tobaksnikotin, som er en økologisk modelplante med en rig specialiseret metabolisme, og som er effektiv mod larverne fra to hjemmehørende planteædere, Lepidoptera Datura (Ms) (meget aggressiv, primært spist). På Solanaceae og Spodoptera littoralis (Sl) er bomuldsbladorme en slags "slægt", hvor værtsplanterne for Solanaceae og andre værter fra andre slægter og familier er planteføde. Vi analyserede MS/MS metabolomikspektret og udtrak statistiske deskriptorer fra informationsteorien for at sammenligne OD- og MT-teorier. Vi skabte specificitetskort for at afsløre identiteten af ​​nøglemetabolitter. Analysen blev udvidet til den hjemmehørende population af N. nasi og nært beslægtede tobaksarter for yderligere at analysere kovariansen mellem plantehormonsignalering og OD-induktion.
For at kunne kortlægge plasticiteten og strukturen af ​​bladmetabolomet hos planteædende tobak, anvendte vi en tidligere udviklet analyse- og beregningsworkflow til omfattende at indsamle og dekonvolvere højopløsningsdatauafhængige MS/MS-spektre fra planteekstrakter (9). Denne udifferentierede metode (kaldet MS/MS) kan konstruere ikke-redundante forbindelsesspektre, som derefter kan bruges til alle analyser på forbindelsesniveau beskrevet her. Disse dekonvolverede plantemetabolitter er af forskellige typer og består af hundredvis til tusindvis af metabolitter (ca. 500-1000 s/MS/MS her). Her betragter vi metabolisk plasticitet inden for rammerne af informationsteori og kvantificerer metabolomets diversitet og professionalisme baseret på Shannon-entropien af ​​den metaboliske frekvensfordeling. Ved hjælp af den tidligere implementerede formel (8) beregnede vi et sæt indikatorer, der kan bruges til at kvantificere metabolomdiversitet (Hj-indikator), metabolisk profilspecialisering (δj-indikator) og metabolisk specificitet af en enkelt metabolit (Si-indikator). Derudover anvendte vi Relative Distance Plasticity Index (RDPI) til at kvantificere herbivorers metabolominducerbarhed (Figur 1A) (30). Inden for denne statistiske ramme behandler vi MS/MS-spektret som den grundlæggende informationsenhed og bearbejder den relative forekomst af MS/MS til et frekvensfordelingskort og bruger derefter Shannon-entropien til at estimere metabolomdiversiteten ud fra det. Metabolomspecialiseringen måles ved den gennemsnitlige specificitet af et enkelt MS/MS-spektrum. Derfor transformeres stigningen i forekomsten af ​​nogle MS/MS-klasser efter herbivorinduktion til spektral inducerbarhed, RDPI og specialisering, dvs. stigningen i δj-indekset, fordi der produceres flere specialiserede metabolitter, og der produceres et højt Si-indeks. Sænkningen af ​​Hj-diversitetsindekset afspejler, at enten antallet af genererede MS/MS reduceres, eller at profilfrekvensfordelingen ændrer sig i en mindre ensartet retning, samtidig med at den samlede usikkerhed reduceres. Gennem Si-indeksberegningen er det muligt at fremhæve, hvilke MS/MS der induceres af bestemte planteædere, mens derimod hvilke MS/MS der ikke reagerer på induktionen, hvilket er en nøgleindikator til at skelne mellem MT- og OD-forudsigelse.
(A) Statistiske deskriptorer anvendt til herbivorøs (H1 til Hx) MS/MS data-inducibilitet (RDPI), diversitet (Hj-indeks), specialisering (δj-indeks) og metabolitspecificitet (Si-indeks). En stigning i specialiseringsgraden (δj) indikerer, at der i gennemsnit vil blive produceret flere herbivorøse specifikke metabolitter, mens et fald i diversitet (Hj) indikerer et fald i produktionen af ​​metabolitter eller ujævn fordeling af metabolitter på distributionskortet. Si-værdien vurderer, om metabolitten er specifik for en given tilstand (her herbivor) eller omvendt opretholdes på samme niveau. (B) Konceptuelt diagram over forsvarsteoriens forudsigelse ved hjælp af informationsteoriens akse. OD-teori forudsiger, at herbivorangreb vil øge forsvarsmetabolitterne og derved øge δj. Samtidig falder Hj, fordi profilen omorganiseres mod den reducerede usikkerhed i metabolisk information. MT-teorien forudsiger, at angreb fra planteædere vil forårsage ikke-retningsbestemte ændringer i metabolomet, hvorved Hj øges som en indikator for øget usikkerhed i metabolisk information og forårsager en tilfældig fordeling af Si. Vi har også foreslået en blandet model, den bedste MT, hvor nogle metabolitter med højere defensive værdier vil være særligt forhøjede (høj Si-værdi), mens andre udviser tilfældige reaktioner (lavere Si-værdi).
Ved hjælp af informationsteori-deskriptorer fortolker vi OD-teorien til at forudsige, at herbivorinducerede ændringer i specielle metabolitter i en ikke-induceret konstitutiv tilstand vil føre til (i) en stigning i metabolisk specificitet (Si-indeks), der driver metabonomisk specificitet (δj-indeks), stigningen i visse specielle metabolitgrupper med højere forsvarsværdi, og (ii) et fald i metabolomdiversitet (Hj-indeks) på grund af ændringen i metabolisk frekvensfordeling til mere leptin-fordeling i kroppen. På niveauet af en enkelt metabolit forventes en ordnet Si-fordeling, hvor metabolitten vil øge Si-værdien i henhold til dens forsvarsværdi (Figur 1B). I denne forbindelse forklarer vi MT-teorien til at forudsige, at excitation vil føre til (i) ikke-retningsbestemte ændringer i metabolitter, der resulterer i et fald i δj-indekset, og (ii) en stigning i Hj-indekset på grund af en stigning i metabolisk usikkerhed. Eller tilfældighed, som kan kvantificeres ved Shannon-entropi i form af generaliseret diversitet. Hvad angår den metaboliske sammensætning, vil MT-teorien forudsige den tilfældige fordeling af Si. Idet vi tager højde for, at visse metabolitter er under specifikke forhold under specifikke forhold, og andre forhold ikke er under specifikke forhold, og deres forsvarsværdi afhænger af miljøet, har vi også foreslået en blandet forsvarsmodel, hvor δj og Hj er fordelt i to langs Si. Ved stigning i alle retninger vil kun visse metabolitgrupper, som har højere forsvarsværdier, øge Si særligt, mens andre vil have en tilfældig fordeling (figur 1B).
For at teste den redefinerede forsvarsteori-forudsigelse på aksen for informationsteori-deskriptoren, frembragte vi ekspert- (Ms) eller generalist- (Sl) herbivorlarver på bladene af Nepenthes pallens (Figur 2A). Ved hjælp af MS/MS-analyse hentede vi 599 ikke-redundante MS/MS-spektre (datafil S1) fra metanolekstrakter af bladvæv indsamlet efter larvefodring. Brug af RDPI-, Hj- og δj-indekser til at visualisere rekonfigurationen af ​​informationsindhold i MS/MS-konfigurationsfiler afslører interessante mønstre (Figur 2B). Den overordnede tendens er, at som beskrevet af informationsdeskriptoren, når larverne fortsætter med at spise blade, stiger graden af ​​al metabolisk reorganisering over tid: 72 timer efter at herbivoren spiser, stiger RDPI signifikant. Sammenlignet med den ubeskadigede kontrol blev Hj signifikant reduceret, hvilket skyldtes den øgede grad af specialisering af den metaboliske profil, som blev kvantificeret af δj-indekset. Denne tilsyneladende tendens er i overensstemmelse med forudsigelserne i OD-teorien, men er inkonsistent med de primære forudsigelser i MT-teorien, som mener, at tilfældige (ikke-retningsbestemte) ændringer i metabolitniveauer bruges som en defensiv camouflage (Figur 1B). Selvom indholdet af den orale sekretions (OS) elicitor og fødeadfærden hos disse to planteædere er forskellige, resulterede deres direkte fødeindtagelse i lignende ændringer i retningerne af Hj og δj i løbet af høstperioderne på 24 timer og 72 timer. Den eneste forskel forekom ved 72 timers RDPI. Sammenlignet med den metabolisme, der blev induceret af Ms-fodring, var den samlede metabolisme induceret af Sl-fodring højere.
(A) Eksperimentelt design: Almindelige grise (S1) eller ekspert (Ms) planteædere fodres med afsaltede blade fra kandeplanter, mens OS af Ms (W + OSMs) til simuleret planteædning bruges til at håndtere punktering af standardiserede bladpositioner i såret. S1 (W + OSSl) larver eller vand (W + W). Kontrollen (C) er et ubeskadiget blad. (B) Inducibilitet (RDPI sammenlignet med kontrolkortet), diversitet (Hj-indeks) og specialiseringsindeks (δj-indeks) beregnet for det specielle metabolitkort (599 MS/MS; datafil S1). Stjerner angiver signifikante forskelle mellem den direkte planteædende fodring og kontrolgruppen (Student's t-test med parret t-test, *P < 0,05 og ***P < 0,001). ns, ikke vigtig. (C) Tidsopløsningsindeks for hoved- (blå boks, aminosyre, organisk syre og sukker; datafil S2) og specielt metabolitspektrum (rød boks 443 MS/MS; datafil S1) efter simuleret herbivorisk behandling. Farvebåndet refererer til 95% konfidensintervallet. Stjernen angiver den signifikante forskel mellem behandlingen og kontrolgruppen [kvadratisk variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Tukeys ærligt signifikante forskel (HSD) for post hoc multiple sammenligninger, *P < 0,05, **P < 0,01 og *** P < 0,001]. (D) Specialisering af scatterplots og specielle metabolitprofiler (gentagne prøver med forskellige behandlinger).
For at undersøge, om den herbivor-inducerede ombygning på metabolomniveau afspejles i ændringerne i niveauet af individuelle metabolitter, fokuserede vi først på de metabolitter, der tidligere er undersøgt i bladene fra Nepenthes pallens med dokumenteret herbivorresistens. Phenoliske amider er hydroxycinnamamid-polyamin-konjugater, der akkumuleres under insekternes herbivoriske proces og er kendt for at reducere insekternes ydeevne (32). Vi søgte i forstadierne til de tilsvarende MS/MS og plottede deres kumulative kinetiske kurver (Figur S1). Ikke overraskende nedreguleres phenolderivater, der ikke er direkte involveret i forsvaret mod herbivorer, såsom klorogensyre (CGA) og rutin, efter herbivoriering. I modsætning herbivorer kan herbivorer gøre phenolamider meget potente. Den kontinuerlige fodring af de to herbivorer resulterede i næsten det samme excitationsspektrum af phenolamider, og dette mønster var især tydeligt for de novo syntese af phenolamider. Det samme fænomen vil blive observeret, når man undersøger 17-hydroxygeranyl nonandiol diterpen glycosider (17-HGL-DTG'er) signalvejen, som producerer et stort antal acykliske diterpener med effektive anti-herbivore funktioner (33), hvoraf Ms Feeding with Sl udløste en lignende ekspressionsprofil (Figur S1)).
Den mulige ulempe ved direkte fodringsforsøg med planteædere er forskellen i bladforbrugshastighed og fodringstid for planteædere, hvilket gør det vanskeligt at eliminere de planteæderspecifikke effekter forårsaget af sår og planteædere. For bedre at kunne løse planteæderartsspecificiteten af ​​den inducerede bladmetaboliske respons simulerede vi fodringen af ​​Ms- og Sl-larver ved straks at påføre den friskindsamlede OS (OSM og OSS1) på standardpunkturen W med ensartede bladpositioner. Denne procedure kaldes W + OS-behandling, og den standardiserer induktionen ved præcist at time starten af ​​den respons, der fremkaldes af planteæderen, uden at forårsage forstyrrende effekter af forskelle i hastigheden eller mængden af ​​vævstab (Figur 2A) (34). Ved hjælp af MS/MS-analyse- og beregningspipelinen hentede vi 443 MS/MS-spektre (datafil S1), som overlappede med de spektre, der tidligere var samlet fra direkte fodringsforsøg. Informationsteorianalysen af ​​dette MS/MS-datasæt viste, at omprogrammeringen af ​​bladspecialiserede metabolomer ved simulering af herbivorer viste OS-specifikke induktioner (Figur 2C). Især forårsagede OSM, sammenlignet med OSS1-behandling, en forstærkning af metabolomspecialiseringen efter 4 timer. Det er værd at bemærke, at sammenlignet med det eksperimentelle datasæt med direkte herbivorfodring, visualiseredes den metaboliske kinetik i todimensionelt rum ved hjælp af Hj og δj som koordinater, og retningen af ​​metabolomspecialiseringen som reaktion på simuleret herbivorbehandling over tid steg konsistent (Figur 2D). Samtidig kvantificerede vi indholdet af aminosyrer, organiske syrer og sukkerarter (datafil S2) for at undersøge, om denne målrettede stigning i metabolomekspertise skyldes omkonfigurationen af ​​den centrale kulstofmetabolisme som reaktion på simulerede herbivorer (Figur S2). For bedre at forklare dette mønster overvågede vi yderligere den metaboliske akkumuleringskinetik for de tidligere diskuterede phenolamid- og 17-HGL-DTG-veje. Den OS-specifikke induktion af planteædere transformeres til et differentielt omlejringsmønster i phenolamidmetabolismen (Figur S3). Phenoliske amider indeholdende coumarin- og caffeoyl-enheder induceres fortrinsvis af OSS1, mens OSM'er udløser en specifik induktion af ferulylkonjugater. For 17-HGL-DTG-signalvejen blev der detekteret differentiel OS-induktion ved downstream malonylering og dimalonyleringsprodukter (Figur S3).
Dernæst undersøgte vi den OS-inducerede transkriptomplasticitet ved hjælp af tidsforløbs-microarray-datasættet, som simulerer brugen af ​​OSM'er til behandling af bladene på rosetplanteblade hos planteædere. Prøveudtagningskinetikken overlapper stort set den kinetik, der blev anvendt i denne metabolomikundersøgelse (35). Sammenlignet med metabolomrekonfigurationen, hvor metabolisk plasticitet er særligt øget over tid, observerer vi forbigående transkriptionsudbrud i blade induceret af Ms, hvor transkriptominducerbarhed (RDPI) og specialisering (δj) er på 1. Der var en signifikant stigning i timer og diversitet (Hj) på dette tidspunkt, hvor ekspressionen af ​​BMP1 var signifikant reduceret, efterfulgt af afslapning af transkriptomspecialisering (Figur S4). Metaboliske genfamilier (såsom P450, glycosyltransferase og BAHD-acyltransferase) deltager i processen med at samle specielle metabolitter fra strukturelle enheder afledt af primær metabolisme, efter den førnævnte tidlige højspecialiseringsmodel. Som et casestudie blev phenylalanin-vejen analyseret. Analysen bekræftede, at kernegenerne i phenolamidmetabolisme er stærkt OS-inducerede hos planteædere sammenlignet med utiltrækkede planter, og at deres ekspressionsmønstre er tæt afstemt. Transkriptionsfaktoren MYB8 og de strukturelle gener PAL1, PAL2, C4H og 4CL i opstrømsdelen af ​​denne signalvej viste tidlig initiering af transkription. Acyltransferaser, der spiller en rolle i den endelige samling af phenolamid, såsom AT1, DH29 og CV86, udviser et forlænget opreguleringsmønster (Figur S4). Ovenstående observationer indikerer, at den tidlige initiering af transkriptomspecialisering og den senere forbedring af metabolomisk specialisering er en koblet tilstand, hvilket kan skyldes det synkrone reguleringssystem, der initierer en kraftig forsvarsrespons.
Rekonfigurationen i plantehormonsignalering fungerer som et regulatorisk lag, der integrerer planteædende information for at omprogrammere planters fysiologi. Efter herbivorsimuleringen målte vi den kumulative dynamik i centrale plantehormonkategorier og visualiserede den tidsmæssige samekspression mellem dem [Pearson-korrelationskoefficient (PCC) > 0,4] (Figur 3A). Som forventet er plantehormoner relateret til biosyntese forbundet inden for plantehormon-samekspressionsnetværket. Derudover er metabolisk specificitet (Si-indeks) kortlagt til dette netværk for at fremhæve de plantehormoner, der induceres af forskellige behandlinger. To hovedområder med planteædende specifik respons er tegnet: det ene er i JA-klyngen, hvor JA (dens biologisk aktive form JA-Ile) og andre JA-derivater viser den højeste Si-score; det andet er ethylen (ET). Gibberellin viste kun en moderat stigning i herbivorspecificitet, mens andre plantehormoner, såsom cytokinin, auxin og abscisinsyre, havde lav induktionsspecificitet for planteædere. Sammenlignet med at bruge W + W alene, kan amplifikationen af ​​peakværdien af ​​JA-derivater gennem OS-applikationen (W + OS) grundlæggende omdannes til en stærk specifik indikator for JA'er. Uventet er det kendt, at OSM og OSS1 med forskelligt elicitorindhold forårsager lignende akkumulering af JA og JA-Ile. I modsætning til OSS1 induceres OSM specifikt og stærkt af OSM'er, mens OSS1 ikke forstærker responsen på basale sår (Figur 3B).
(A) Analyse af co-ekspressionsnetværk baseret på PCC-beregning af simulering af herbivor-induceret plantehormonakkumuleringskinetik. Knuden repræsenterer et enkelt plantehormon, og knudens størrelse repræsenterer Si-indekset specifikt for plantehormonet mellem behandlinger. (B) Akkumulering af JA, JA-Ile og ET i blade forårsaget af forskellige behandlinger angivet med forskellige farver: abrikos, W + OSM; blå, W + OSSl; sort, W + W; grå, C (kontrol). Stjerner angiver signifikante forskelle mellem behandling og kontrol (tovejs ANOVA efterfulgt af Tukey HSD post hoc multiple sammenligning, *** P <0,001). Informationsteorianalyse af (C)697 MS/MS (datafil S1) i JA-biosyntese og forringet perceptionsspektrum (irAOC og irCOI1) og (D)585 MS/MS (datafil S1) i ETR1 med forringet ET-signal. To simulerede herbivorbehandlinger udløste plantelinjer og kontrolplanter med tomme vehikler (EV). Stjerner angiver signifikante forskelle mellem W+OS-behandling og ubeskadiget kontrol (tovejs ANOVA efterfulgt af Tukey HSD post hoc multiple sammenligning, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001). (E) Spredte grafer af spredt modstand mod specialisering. Farverne repræsenterer forskellige genetisk modificerede stammer; symbolerne repræsenterer forskellige behandlingsmetoder: trekant, W + OSS1; rektangel, W + OSM; cirkel C
Dernæst bruger vi en genetisk modificeret stamme af svækket Nepenthes (irCOI1 og sETR1) i nøgletrinene i JA- og ET-biosyntese (irAOC og irACO) og perception (irCOI1 og sETR1) til at analysere metabolismen af ​​disse to plantehormoner på planteædere. Det relative bidrag fra omprogrammering. I overensstemmelse med tidligere eksperimenter bekræftede vi induktionen af ​​herbivore-OS i tomme bærerplanter (EV) (Figur 3, C til D) og det samlede fald i Hj-indekset forårsaget af OSM, mens δj-indekset steg. Responsen er mere udtalt end den respons, der udløses af OSS1. En to-linjers graf, der bruger Hj og δj som koordinater, viser den specifikke deregulering (Figur 3E). Den mest åbenlyse tendens er, at i stammer, der mangler JA-signal, er ændringerne i metabolomdiversitet og specialisering forårsaget af planteædere næsten fuldstændigt elimineret (Figur 3C). I modsætning hertil dæmper den tavse ET-opfattelse i sETR1-planter, selvom den samlede effekt på ændringer i planteædende metabolisme er meget lavere end for JA-signalering, forskellen i Hj- og δj-indekser mellem OSM- og OSS1-excitationer (Figur 3D og Figur S5). Dette indikerer, at ET-signaltransduktion ud over kernefunktionen af ​​JA-signaltransduktion også fungerer som en finjustering af den artsspecifikke metaboliske respons hos planteædere. I overensstemmelse med denne finjusteringsfunktion var der ingen ændring i den samlede metabolominducerbarhed i sETR1-planter. På den anden side inducerede irACO-planter sammenlignet med sETR1-planter lignende samlede amplituder af metaboliske ændringer forårsaget af planteædere, men viste signifikant forskellige Hj- og δj-scorer mellem OSM- og OSS1-udfordringer (Figur S5).
For at identificere specialiserede metabolitter, der bidrager væsentligt til planteæderes artsspecifikke respons, og finjustere deres produktion gennem ET-signaler, anvendte vi den tidligere udviklede strukturelle MS/MS-metode. Denne metode er baseret på bi-clustering-metoden til at genudlede den metaboliske familie fra MS/MS-fragmenter [normaliseret punktprodukt (NDP)] og similaritetsscore baseret på neutralt tab (NL). MS/MS-datasættet konstrueret gennem analyse af ET-transgene linjer producerede 585 MS/MS (datafil S1), som blev opløst ved at gruppere dem i syv hoved-MS/MS-moduler (M) (Figur 4A). Nogle af disse moduler er tæt pakket med tidligere karakteriserede specielle metabolitter: for eksempel er M1, M2, M3, M4 og M7 rige på forskellige phenolderivater (M1), flavonoidglykosider (M2), acylsukkerarter (M3 og M4) og 17-HGL-DTG (M7). Derudover beregnes den metabolisk specifikke information (Si-indeks) for en enkelt metabolit i hvert modul, og dens Si-fordeling kan ses intuitivt. Kort sagt er MS/MS-spektre, der udviser høj herbivorisk og genotypespecificitet, karakteriseret ved høje Si-værdier, og kurtose-statistikker indikerer fordelingen af ​​pels på højre halehjørne. En sådan mager kolloidfordeling blev detekteret i M1, hvor phenolamid viste den højeste Si-fraktion (Figur 4B). Den tidligere nævnte herbivorøst inducerbare 17-HGL-DTG i M7 viste en moderat Si-score, hvilket indikerer en moderat grad af differentiel regulering mellem de to OS-typer. I modsætning hertil er de fleste konstitutivt producerede specialiserede metabolitter, såsom rutin, CGA og acylsukkerarter, blandt de laveste Si-scorer. For bedre at undersøge den strukturelle kompleksitet og Si-fordelingen mellem specielle metabolitter blev der konstrueret et molekylært netværk for hvert modul (Figur 4B). En vigtig forudsigelse af OD-teorien (opsummeret i figur 1B) er, at reorganiseringen af ​​specielle metabolitter efter herbivoriøsitet bør føre til envejsændringer i metabolitter med høj forsvarsværdi, især ved at øge deres specificitet (i modsætning til tilfældig fordeling) (Mode) Defensiv metabolit forudsagt af MT-teorien. De fleste af de phenolderivater, der akkumuleres i M1, er funktionelt relateret til faldet i insekternes ydeevne (32). Ved sammenligning af Si-værdierne i M1-metabolitterne mellem de inducerede blade og de indgående blade i EV-kontrolplanterne efter 24 timer observerede vi, at den metaboliske specificitet af mange metabolitter efter herbivore insekter har en signifikant stigende tendens (figur 4C). Den specifikke stigning i Si-værdi blev kun detekteret i defensive phenolamider, men ingen stigning i Si-værdi blev detekteret i andre phenoler og ukendte metabolitter, der sameksisterer i dette modul. Dette er en specialiseret model, der er relateret til OD-teorien. De vigtigste forudsigelser af metaboliske ændringer forårsaget af herbivorer er konsistente. For at teste, om denne særlige egenskab ved phenolamidspektret blev induceret af OS-specifik ET, plottede vi metabolittens Si-indeks og forårsagede en differentiel ekspressionsværdi mellem OSM og OSS1 i EV- og sETR1-genotyperne (Figur 4D). I sETR1 blev den phenamid-inducerede forskel mellem OSM og OSS1 kraftigt reduceret. Bi-clusteringsmetoden blev også anvendt på MS/MS-data indsamlet i stammer med utilstrækkelig JA til at udlede de vigtigste MS/MS-moduler relateret til JA-reguleret metabolisk specialisering (Figur S6).
(A) Klyngeresultaterne for 585 MS/MS baseret på delt fragment (NDP-lighed) og delt neutralt tab (NL-lighed) resulterer i, at modulet (M) er konsistent med den kendte forbindelsesfamilie, eller ved ukendt eller dårligt metaboliseret metabolitsammensætning. Ved siden af ​​hvert modul vises den metabolitspecifikke (MS/MS) fordeling (Si). (B) Modulært molekylært netværk: Knudepunkter repræsenterer MS/MS og kanter, NDP (rød) og NL (blå) MS/MS-scorer (cut-off, > 0,6). Det graduerede metabolitspecificitetsindeks (Si) farvet baseret på modulet (venstre) og kortlagt til det molekylære netværk (højre). (C) Modul M1 af EV-plante i konstitutiv (kontrol) og induceret tilstand (simuleret herbivor) efter 24 timer: molekylært netværksdiagram (Si-værdien er knudestørrelsen, defensiv phenolamid er fremhævet med blåt). (D) M1-molekylært netværksdiagram for spektrumlinjen sETR1 med forringet EV- og ET-opfattelse: den phenoliske forbindelse repræsenteret af den grønne cirkelnode og den signifikante forskel (P-værdi) mellem W + OSM- og W + OSS1-behandlinger som nodestørrelse. CP, N-caffeoyl-tyrosin; CS, N-caffeoyl-spermidin; FP, N-ferulsyreester-urinsyre; FS, N-ferulyl-spermidin; CoP, N', N“-Coumarolyl-tyrosin; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidin; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidin; Lycium barbarum i wolfberry-Son; Nick. O-AS, O-acylsukker.
Vi udvidede yderligere analysen fra en enkelt attenueret Nepenthes-genotype til naturlige populationer, hvor stærke intraspecifikke ændringer i planteædende JA-niveauer og specifikke metabolitniveauer tidligere er blevet beskrevet i naturlige populationer (26). Brug dette datasæt til at dække 43 kimplasmer. Disse kimplasmer består af 123 plantearter fra N. pallens. Disse planter blev taget fra frø indsamlet i forskellige oprindelige habitater i Utah, Nevada, Arizona og Californien (Figur S7), og vi beregnede metabolomdiversiteten (her kaldet populationsniveau) β-diversitet) og specialiseringen forårsaget af OSM. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser observerede vi en bred vifte af metaboliske ændringer langs Hj- og δj-akserne, hvilket indikerer, at kimplasmer har signifikante forskelle i plasticiteten af ​​deres metaboliske reaktioner på planteædere (Figur S7). Denne organisering minder om tidligere observationer om det dynamiske område af JA-ændringer forårsaget af planteædere og har opretholdt en meget høj værdi i en enkelt population (26, 36). Ved at bruge JA og JA-Ile til at teste den overordnede niveaukorrelation mellem Hj og δj, fandt vi, at der er en signifikant positiv korrelation mellem JA og metabolom β-diversitets- og specialiseringsindekset (Figur S7). Dette tyder på, at den herbivor-inducerede heterogenitet i JA-induktion, der detekteres på populationsniveau, kan skyldes centrale metaboliske polymorfier forårsaget af selektion fra insektherbivorer.
Tidligere undersøgelser har vist, at tobakstyper adskiller sig meget i type og relativ afhængighed af inducerede og konstitutive metaboliske forsvar. Det menes, at disse ændringer i anti-herbivore signaltransduktion og forsvarsevner reguleres af insektpopulationstryk, planters livscyklus og forsvarsproduktionsomkostninger i den niche, hvor en given art vokser. Vi undersøgte konsistensen af ​​bladmetabolomombygning induceret af herbivorer af seks Nicotiana-arter, der er hjemmehørende i Nordamerika og Sydamerika. Disse arter er tæt beslægtede med Nepenthes Nordamerika, nemlig Nicolas Bociflo, La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineær tobak, tobak (Nicotiana spegazzinii) og tobaksbladtobak (Nicotiana obtusifolia) (Figur 5A) (37). Seks af disse arter, inklusive den velkarakteriserede art N. please, er etårige planter af petunia-kladen, og obtusifolia N. er stauder af søsterkladen Trigonophyllae (38). Efterfølgende blev W + W, W + OSM og W + OSS1 induktion udført på disse syv arter for at studere den metaboliske omlejring af insekters fødeindtagelse på artsniveau.
(A) Et bootstrap fylogenetisk træ baseret på maksimal sandsynlighed [for nuklear glutaminsyntese (38)] og den geografiske fordeling af syv nært beslægtede Nicotiana-arter (forskellige farver) (37). (B) Et scatterplot af specialiseret diversitet for de metaboliske profiler af syv Nicotiana-arter (939 MS/MS; datafil S1). På artsniveau er metabolomdiversiteten negativt korreleret med graden af ​​specialisering. Analysen af ​​korrelationen på artsniveau mellem metabolisk diversitet og specialisering og JA-akkumulering er vist i figur 2. S9. Farve, forskellige typer; trekant, W + OSS1; rektangel, W + OSM; (C) Nicotiana JA og JA-Ile dynamik er rangeret efter OS excitationsamplitude (tovejs ANOVA og Tukey HSD efter multipel sammenligning, * P <0,05, ** P <0,01 og * ** For sammenligning af W + OS og W + W, P <0,001). Boksplot af (D) diversitet og (E) specialisering af hver art efter simulering af planteædende og methyl JA (MeJA). Stjernen angiver den signifikante forskel mellem W + OS og W + W eller lanolin plus W (Lan + W) eller Lan plus MeJA (Lan + MeJa) og Lan-kontrol (tovejs variansanalyse, efterfulgt af Tukey's HSD post hoc multiple sammenligning, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001).
Ved hjælp af den dobbelte klyngemetode identificerede vi 9 moduler med 939 MS/MS (datafil S1). Sammensætningen af ​​MS/MS rekonfigureret ved forskellige behandlinger varierer meget mellem forskellige moduler og arter (Figur S8). Visualisering af Hj (her omtalt som artsniveau-γ-diversitet) og δj afslører, at forskellige arter aggregerer i meget forskellige grupper i det metaboliske rum, hvor artsniveauopdeling normalt er mere fremtrædende end excitation. Med undtagelse af N. linear og N. obliquus udviser de et bredt dynamisk område af induktionseffekter (Figur 5B). I modsætning hertil har arter som N. purpurea og N. obtusifolia en mindre tydelig metabolisk respons på behandling, men metabolomet er mere forskelligartet. Den artsspecifikke fordeling af den inducerede metaboliske respons resulterede i en signifikant negativ korrelation mellem specialisering og gamma-diversitet (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS-inducerede ændringer i JA-niveauer er positivt korreleret med metabolomspecialisering og negativt korreleret med den metaboliske gammadiversitet, der udvises af hver art (Figur 5B og Figur S9). Det er værd at bemærke, at de arter, der i daglig tale omtales som "signalrespons"-arter i Figur 5C, såsom Nepenthes nematoder, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute og Nepenthes attenuated, forårsagede signifikante tegn efter 30 minutter. De nylige OS-specifikke JA- og JA-Ile-udbrud, mens andre bakterier kaldet "signal-ikke-responsive", såsom Nepenthes mills, Nepenthes powdery og N. obtusifolia, kun viser JA-Ile Edge-induktion uden nogen OS-specificitet (Figur 5C). På det metaboliske niveau, som nævnt ovenfor, for den attenuerede Nepenthes, udviste de signalresponsive stoffer OS-specificitet og øgede δj signifikant, samtidig med at Hj reduceredes. Denne OS-specifikke priming-effekt blev ikke detekteret i arter klassificeret som ikke-reaktive signalarter (Figur 5, D og E). OS-specifikke metabolitter deles hyppigere mellem signalresponsive arter, og disse signalklynger klynger sig sammen med arter med svagere signalresponser, mens arter med svagere signalresponser viser mindre indbyrdes afhængighed (Figur S8). Dette resultat indikerer, at den OS-specifikke induktion af JA'er og den OS-specifikke rekonfiguration af downstream-metabolomet er koblet på artsniveau.
Dernæst brugte vi en lanolinpasta indeholdende methyl JA (MeJA) til at behandle planter for at undersøge, om disse koblingsmåder er begrænset af tilgængeligheden af ​​JA påført af eksogen JA, som vil være i planternes cytoplasma. Hurtig deesterificering er JA. Vi fandt den samme tendens til den gradvise ændring fra signalresponsive arter til signal-ikke-responsive arter forårsaget af den kontinuerlige tilførsel af JA (Figur 5, D og E). Kort sagt, MeJA-behandling omprogrammerede kraftigt metabolomerne hos lineære nematoder, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens og N. mikimotoi, hvilket resulterede i en signifikant stigning i δj og et fald i Hj. N. purpurea viste kun en stigning i δj, men ikke Hj. N. obtusifolia, som tidligere har vist sig at akkumulere ekstremt lave niveauer af JA'er, reagerer også dårligt på MeJA-behandling med hensyn til metabolomrekonfiguration. Disse resultater indikerer, at JA-produktion eller signaltransduktion er fysiologisk begrænset hos signal-ikke-responsive arter. For at teste denne hypotese undersøgte vi de fire arter (N. pallens, N. mills, N. pink og N. microphylla) induceret af W + W, W + OSM'er og W + OSS1 Transcriptome (39). I overensstemmelse med mønsteret for metabolomremodellering er arterne godt adskilte i transkriptomrummet, hvoraf N. attenuated viste den højeste OS-inducerede RDPI, mens N. gracilis havde den laveste (Figur 6A). Det blev imidlertid fundet, at transkriptomdiversiteten induceret af N. oblonga var den laveste blandt de fire arter, i modsætning til den højeste metabonomiske diversitet af N. oblonga, der tidligere er vist i syv arter. Tidligere undersøgelser har vist, at et sæt gener relateret til tidlige forsvarssignaler, herunder JA-signaler, forklarer specificiteten af ​​tidlige forsvarsresponser induceret af herbivorrelaterede elicitorer i Nicotiana-arter (39). Sammenligning af JA-signalvejene mellem disse fire arter afslørede et interessant mønster (Figur 6B). De fleste gener i denne signalvej, såsom AOC, OPR3, ACX og COI1, viste relativt høje induktionsniveauer i disse fire arter. Imidlertid omdanner et nøglegen, JAR4, JA til dets biologisk aktive form af JA-Ile-akkumulerede transkripter, og dets transkriptionsniveau er meget lavt, især i N. mills, Nepenthes pieris og N. microphylla. Derudover blev kun transkriptet af et andet gen, AOS, ikke detekteret i N. bifidum. Disse ændringer i genekspression kan være ansvarlige for de ekstreme fænotyper induceret af den lave JA-produktion i signal-anergiske arter og induktionen af ​​N. gracilis.
(A) Informationsteoretisk analyse af reprogrammeringen af ​​tidlige transkriptionelle responser hos fire nært beslægtede tobaksarter, der blev samplet 30 minutter efter induktion af planteædende organismer. RDPI beregnes ved at sammenligne bladene induceret af den planteædende OS med sårkontrollen. Farverne angiver forskellige arter, og symbolerne angiver forskellige behandlingsmetoder. (B) Analyse af genekspression i JA-signalveje blandt fire arter. Den forenklede JA-sti er vist ved siden af ​​boksplottet. Forskellige farver angiver forskellige behandlingsmetoder. Asterisken angiver, at der er en signifikant forskel mellem W + OS-behandlingen og W + W-kontrollen (for Student's t-test for parvise forskelle, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001). OPDA, 12-oxophytodiensyre; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentan-1-octansyre.
I den sidste del undersøgte vi, hvordan insektartsspecifik ombygning af metabolomet hos forskellige plantearter kan være resistent over for planteædere. Tidligere forskning har lagt vægt på Nicotiana-slægten. Deres resistens over for Ms og larver varierer meget (40). Her undersøgte vi forbindelsen mellem denne model og deres metaboliske plasticitet. Ved at bruge ovenstående fire tobaksarter og teste korrelationen mellem diversiteten og specialiseringen af ​​metabolomet forårsaget af planteædere og planters resistens over for Ms og Sl, fandt vi, at resistens, diversitet og specialisering over for generalisten Sl er positivt korreleret, mens korrelationen mellem resistens over for ekspert-Sl og specialisering er svag, og korrelationen med diversitet ikke er signifikant (Figur S10). Med hensyn til S1-resistens havde både den svækkede N. chinensis og N. gracilis, som tidligere har vist sig at udvise både JA-signaltransduktionsniveauer og metabolomplasticitet, meget forskellige reaktioner på planteæderinduktion, og de udviste også lignende høj resistens. Køn.
I de sidste tres år har planteforsvarsteorien leveret en teoretisk ramme, baseret på hvilken forskere har forudsagt et betydeligt antal udviklinger og funktioner af plantespecialiserede metabolitter. De fleste af disse teorier følger ikke den normale procedure med stærke inferenser (41). De foreslår nøgleforudsigelser (3) på samme analyseniveau. Når testningen af ​​nøgleforudsigelser tillader analyse af specifikke teorier, vil dette gøre Feltet bevæger sig fremad. blive understøttet, men afvis andre (42). I stedet fremsætter den nye teori forudsigelser på forskellige analyseniveauer og tilføjer et nyt lag af beskrivende overvejelser (42). Imidlertid kan de to teorier, der er foreslået på det funktionelle niveau, MT og OD, let forklares som vigtige forudsigelser af specialiserede metaboliske ændringer forårsaget af planteædere: OD-teorien mener, at ændringer i det specialiserede metaboliske "rum" er meget retningsbestemte. MT-teorien mener, at disse ændringer vil være ikke-retningsbestemte og tilfældigt placeret i det metaboliske rum og har tendens til at have metabolitter med høj forsvarsværdi. Tidligere undersøgelser af OD- og MT-forudsigelser er blevet testet ved hjælp af et smalt sæt af a priori "forsvars"-forbindelser. Disse metabolit-centriske tests udelukker muligheden for at analysere omfanget og banen af ​​metabolomrekonfiguration under herbivori, og tillader ikke testning inden for en konsistent statistisk ramme for at kræve nøgleforudsigelser, der kan betragtes som en helhed for at kvantificere ændringer i plantemetabolomer. Her brugte vi den innovative teknologi inden for metabolomik baseret på beregningsmæssig MS og udførte dekonvolutions-MS-analyse i de generelle informationsteori-deskriptorer for at teste sondringen mellem de to foreslåede på globalt metabolomisk niveau. Den vigtigste forudsigelse for denne teori. Informationsteori er blevet anvendt på mange områder, især i forbindelse med biodiversitet og næringsstofstrømningsforskning (43). Men så vidt vi ved, er dette den første anvendelse, der bruges til at beskrive planters metaboliske informationsrum og løse økologiske problemer relateret til midlertidige metaboliske ændringer som reaktion på miljømæssige signaler. Især ligger denne metodes evne i dens evne til at sammenligne mønstre inden for og mellem plantearter for at undersøge, hvordan herbivorer har udviklet sig fra forskellige arter til makroevolutionære mønstre mellem arter på forskellige evolutionsniveauer. Metabolisme.
Principal component analysis (PCA) konverterer et multivariat datasæt til et dimensionalitetsreduktionsrum, så dataenes hovedtendens kan forklares. Derfor bruges det normalt som en udforskende teknik til at analysere datasættet, såsom dekonvolutionsmetabolomer. Dimensionsreduktion vil dog miste en del af informationsindholdet i datasættet, og PCA kan ikke give kvantitativ information om karakteristika, der er særligt relevante for økologisk teori, såsom: hvordan planteædere omkonfigurerer diversitet inden for specialiserede felter (f.eks. rigdom, distribution og abundans) metabolitter? Hvilke metabolitter er prædiktorer for den inducerede tilstand hos en given planteæder? Fra et specificitets-, diversitets- og inducerbarhedsperspektiv nedbrydes informationsindholdet i den bladspecifikke metabolitprofil, og det konstateres, at planteæderes indtagelse kan aktivere specifik metabolisme. Uventet observerede vi, som beskrevet i de implementerede informationsteoriindikatorer, at den resulterende metaboliske situation har en stor overlapning efter angrebene fra de to planteædere (den natfodrede generalist Sl) og Solanaceae-eksperten Ms. Selvom deres fødeadfærd og koncentration er signifikant forskellige. Fedtsyre-aminosyrekonjugat (FAC) initiator i OS (31). Ved at bruge planteædende OS til at behandle standardiserede punkteringssår viste simuleret planteæderbehandling også en lignende tendens. Denne standardiserede procedure til simulering af planters reaktion på planteæderangreb eliminerer de forstyrrende faktorer forårsaget af ændringer i planteæderes spiseadfærd, som fører til varierende grader af skade på forskellige tidspunkter (34). FAC, som er kendt for at være hovedårsagen til OSM, reducerer JAS og andre plantehormonresponser i OSS1, mens OSS1 reduceres hundredvis af gange (31). OSS1 forårsagede dog lignende niveauer af JA-akkumulering sammenlignet med OSM. Det er tidligere blevet vist, at JA-responset i svækket Nepenthes er meget følsomt over for OSM, hvor FAC kan opretholde sin aktivitet, selv ved fortynding 1:1000 med vand (44). Sammenlignet med OSM er FAC i OSS1 derfor tilstrækkeligt til at inducere et tilstrækkeligt JA-udbrud, selvom det er meget lavt. Tidligere undersøgelser har vist, at porinlignende proteiner (45) og oligosaccharider (46) kan bruges som molekylære spor til at udløse planteforsvarsresponser i OSS1. Det er dog stadig uklart, om disse elicitorer i OSS1 er ansvarlige for den akkumulering af JA, der observeres i den aktuelle undersøgelse.
Selvom der er få studier, der beskriver de differentielle metaboliske fingeraftryk forårsaget af anvendelsen af ​​forskellige herbivorer eller eksogene JA eller SA (salicylsyre) (47), har ingen forstyrret den herbivore artsspecifikke forstyrrelse i plantens græsnetværk og dens virkninger på de specifikke personlige oplysninger. Den samlede virkning af metabolisme undersøges systematisk. Denne analyse bekræftede yderligere, at den interne hormonnetværksforbindelse med andre plantehormoner end JA'er former specificiteten af ​​den metaboliske reorganisering forårsaget af herbivorer. Især opdagede vi, at ET forårsaget af OSM var signifikant større end den forårsaget af OSS1. Denne tilstand er i overensstemmelse med mere FAC-indhold i OSM, hvilket er en nødvendig og tilstrækkelig betingelse for at udløse et ET-udbrud (48). I forbindelse med interaktionen mellem planter og herbivorer er ET's signalfunktion på plantespecifik metabolitdynamik stadig sporadisk og retter sig kun mod en enkelt forbindelsesgruppe. Derudover har de fleste studier anvendt eksogen anvendelse af ET eller dets forstadier eller forskellige inhibitorer til at studere reguleringen af ​​ET, blandt hvilke disse eksogene kemiske anvendelser vil producere mange ikke-specifikke bivirkninger. Så vidt vi ved, repræsenterer denne undersøgelse den første storstilede systematiske undersøgelse af ET's rolle i brugen af ​​ET til at producere og opfatte forringede transgene planter for at koordinere plantemetabolomdynamikken. Herbivorspecifik ET-induktion kan i sidste ende modulere metabolomresponset. Den mest betydningsfulde er den transgene manipulation af ET-biosyntese (ACO) og perceptions (ETR1) gener, der afslørede den herbivorspecifikke de novo akkumulering af phenolamider. Det er tidligere blevet vist, at ET kan finjustere JA-induceret nikotinakkumulering ved at regulere putrescin N-methyltransferase (49). Fra et mekanisk synspunkt er det imidlertid ikke klart, hvordan ET finjusterer induktionen af ​​phenamid. Ud over ET's signaltransduktionsfunktion kan den metaboliske flux også shuntes til S-adenosyl-1-methionin for at regulere investeringen i polyaminophenolamider. S-adenosyl-1-methionin er ET og et almindeligt mellemprodukt i polyaminbiosyntesevejen. Mekanismen, hvorved ET-signalet regulerer niveauet af phenolamid, kræver yderligere undersøgelse.
På grund af det store antal specielle metabolitter med ukendt struktur har den intense opmærksomhed på specifikke metaboliske kategorier i lang tid ikke været i stand til strengt at vurdere de tidsmæssige ændringer i metabolisk diversitet efter biologiske interaktioner. Baseret på informationsteorianalyse er hovedresultatet af MS/MS-spektrumopsamling baseret på objektive metabolitter i øjeblikket, at planteædere, der spiser eller simulerer planteædere, fortsætter med at reducere den samlede metaboliske diversitet af bladmetabolomet, samtidig med at de øger dets specialiseringsgrad. Denne midlertidige stigning i metabolomspecificitet forårsaget af planteædere er forbundet med en synergistisk stigning i transkriptomspecificitet. Den egenskab, der bidrager mest til denne større metabolomspecialisering (med en højere Si-værdi), er den specielle metabolit med den tidligere karakteriserede planteædende funktion. Denne model er i overensstemmelse med forudsigelsen i OD-teorien, men forudsigelsen af ​​MT relateret til tilfældigheden af ​​metabolomreprogrammering er ikke konsistent. Disse data er dog også i overensstemmelse med forudsigelsen i den blandede model (bedste MT; figur 1B), fordi andre ukarakteriserede metabolitter med ukendte forsvarsfunktioner stadig kan følge en tilfældig Si-fordeling.
Et bemærkelsesværdigt mønster, der yderligere indfanges af denne forskning, er, at fra mikroevolutionsniveauet (enkelt plante og tobakspopulation) til en større evolutionær skala (nært beslægtede tobaksarter) er forskellige niveauer af evolutionær organisation i "bedste forsvar". Der er betydelige forskelle i planteæderes evner. Moore et al. (20) og Kessler og Kalske (1) foreslog uafhængigt af hinanden at konvertere de tre funktionelle niveauer af biodiversitet, som Whittaker (50) oprindeligt adskilte, til de konstitutive og inducerede tidsmæssige ændringer af kemisk diversitet; disse forfattere opsummerede hverken dette. Procedurerne for storstilet metabolomdataindsamling beskriver heller ikke, hvordan man beregner metabolisk diversitet ud fra disse data. I denne undersøgelse vil mindre justeringer af Whittakers funktionelle klassificering betragte α-metabolisk diversitet som diversiteten af ​​MS/MS-spektre i en given plante og β-metabolisk diversitet som den grundlæggende intraspecifikke metabolisme af en gruppe populationer. Rum, og γ-metabolisk diversitet vil være en udvidelse af analysen af ​​lignende arter.
JA-signalet er essentielt for en bred vifte af herbivore metaboliske reaktioner. Der mangler dog grundig kvantitativ testning af bidraget fra intraspecifik regulering af JA-biosyntese til metabolomdiversitet, og hvorvidt JA-signalet er et generelt sted for stressinduceret metabolisk diversificering på en højere makroevolutionær skala er stadig uafklaret. Vi observerede, at den herbivore natur af Nepenthes herbivorous inducerer metabolomspecialisering, og at variationen af ​​metabolomspecialisering inden for populationen af ​​Nicotiana-arter og blandt nært beslægtede Nicotiana-arter er systematisk positivt korreleret med JA-signalering. Derudover vil den metaboliske specificitet induceret af en enkelt genotype-herbivor blive ophævet, når JA-signalet er forringet (Figur 3, C og E). Da ændringerne i det metaboliske spektrum for de naturligt svækkede Nepenthes-populationer for det meste er kvantitative, kan ændringerne i den metaboliske β-diversitet og specificitet i denne analyse i høj grad skyldes den stærke excitation af metabolitrige forbindelseskategorier. Disse forbindelsesklasser dominerer en del af metabolomprofilen og fører til en positiv korrelation med JA-signaler.
Fordi de biokemiske mekanismer hos den tobaksart, der er nært beslægtet med den, er meget forskellige, identificeres metabolitterne specifikt i det kvalitative aspekt, så det er mere analytisk. Informationsteoriens behandling af den indfangede metaboliske profil afslører, at herbivorøs induktion forværrer afvejningen mellem metabolisk gamma-diversitet og specialisering. JA-signalet spiller en central rolle i denne afvejning. Stigningen i metabolomspecialisering er i overensstemmelse med den primære OD-forudsigelse og er positivt korreleret med JA-signalet, mens JA-signalet er negativt korreleret med metabolisk gamma-diversitet. Disse modeller indikerer, at planters OD-kapacitet hovedsageligt bestemmes af JA's plasticitet, hvad enten det er på en mikroevolutionær skala eller på en større evolutionær skala. Eksogene JA-anvendelseseksperimenter, der omgår JA-biosyntesefejl, afslører yderligere, at nært beslægtede tobaksarter kan skelnes mellem signalresponsive og signal-ikke-responsive arter, ligesom deres JA-tilstand og metabolomplasticitet induceret af herbivorer. Signal-ikke-responsive arter kan ikke reagere på grund af deres manglende evne til at producere endogen JA og er derfor underlagt fysiologiske begrænsninger. Dette kan være forårsaget af mutationer i nogle nøglegener i JA-signalvejen (AOS og JAR4 i N. crescens). Dette resultat fremhæver, at disse makroevolutionære mønstre mellem arter primært kan være drevet af ændringer i intern hormonopfattelse og -responsivitet.
Ud over interaktionen mellem planter og planteædere er udforskningen af ​​metabolisk diversitet relateret til alle vigtige teoretiske fremskridt inden for forskning i biologisk tilpasning til miljøet og udviklingen af ​​komplekse fænotypiske træk. Med stigningen i mængden af ​​data indsamlet af moderne MS-instrumenter kan hypotesetestning om metabolisk diversitet nu overskride individuelle/kategoriske metabolitforskelle og udføre global analyse for at afsløre uventede mønstre. I processen med storskalaanalyse er en vigtig metafor ideen om at udtænke meningsfulde kort, der kan bruges til at udforske data. Derfor er et vigtigt resultat af den nuværende kombination af objektiv MS/MS-metabolomik og informationsteori, at den giver en simpel metrik, der kan bruges til at konstruere kort til at gennemse den metaboliske diversitet på forskellige taksonomiske skalaer. Det er det grundlæggende krav i denne metode. Studiet af mikro-/makroevolution og samfundsøkologi.
På det makroevolutionære niveau er kernen i Ehrlich og Ravens (51) plante-insekt-koevolutionsteori at forudsige, at variationen i interarts metabolisk diversitet er årsagen til diversificeringen af ​​planteslægter. I de halvtreds år siden udgivelsen af ​​dette skelsættende værk er denne hypotese dog sjældent blevet testet (52). Dette skyldes i høj grad de fylogenetiske karakteristika ved sammenlignelige metaboliske karakteristika på tværs af langdistanceplantelinjer. Sjældenheden kan bruges til at forankre målanalysemetoder. Den nuværende MS/MS-arbejdsgang, der behandles af informationsteori, kvantificerer den strukturelle MS/MS-lighed af ukendte metabolitter (uden forudgående metabolitvalg) og konverterer disse MS/MS'er til et sæt af MS/MS, således at disse makroevolutionære modeller i professionel metabolisme sammenlignes i klassificeringsskala. Enkle statistiske indikatorer. Processen ligner fylogenetisk analyse, som kan bruge sekvensjustering til at kvantificere diversificeringshastigheden eller karakterudviklingen uden forudgående forudsigelse.
På det biokemiske niveau viser screeningshypotesen fra Firn og Jones (53), at metabolisk diversitet opretholdes på forskellige niveauer for at tilvejebringe råmaterialer til at udøve de biologiske aktiviteter af tidligere ubeslægtede eller substituerede metabolitter. Informationsteorimetoder giver en ramme, hvor disse metabolitspecifikke evolutionære overgange, der forekommer under metabolitspecialisering, kan kvantificeres som en del af den foreslåede evolutionære screeningsproces: biologisk aktiv tilpasning fra lav specificitet til høj specificitet. Hæmmede metabolitter i et givet miljø.
Alt i alt blev der i molekylærbiologiens tidlige dage udviklet vigtige planteforsvarsteorier, og deduktive hypotesedrevne metoder anses bredt for at være det eneste middel til videnskabelige fremskridt. Dette skyldes i høj grad de tekniske begrænsninger ved at måle hele metabolomet. Selvom hypotesedrevne metoder er særligt nyttige til at vælge andre årsagsmekanismer, er deres evne til at fremme vores forståelse af biokemiske netværk mere begrænset end de beregningsmetoder, der i øjeblikket er tilgængelige i moderne dataintensiv videnskab. Derfor ligger teorier, der ikke kan forudsiges, langt uden for rammerne af tilgængelige data, så den hypotetiske formel/testcyklus for fremskridt inden for forskningsfeltet kan ikke afskaffes (4). Vi forudser, at den beregningsmæssige arbejdsgang for metabolomik, der introduceres her, kan genoplive interessen for de nylige (hvordan) og endelige (hvorfor) problemstillinger vedrørende metabolisk diversitet og bidrage til en ny æra af teoretisk styret datavidenskab. Æraen undersøgte de vigtige teorier, der inspirerede tidligere generationer.
Direkte herbivorfodring udføres ved at opdrætte en larve i andet stadie eller en Sl-larve på et enkelt blegfarvet kandeblad fra en enkelt rosenblomstrende plante, med 10 plantereplikater pr. plante. Insektlarverne blev fastklemt med klemmer, og det resterende bladvæv blev indsamlet 24 og 72 timer efter infektion og lynfrosset, og metabolitterne blev ekstraheret.
Simuler planteædende behandling på en meget synkroniseret måde. Metoden går ud på at bruge stofmønsterhjul til at punktere tre rækker torne på hver side af midterribben på plantens tre fuldt udfoldede blade under stofgirlandens vækstfase og straks påføre 1:5 fortyndet Ms. Eller brug behandskede fingre til at indsætte S1 OS i punkteringssåret. Høst og behandl et blad som beskrevet ovenfor. Brug den tidligere beskrevne metode til at ekstrahere primære metabolitter og plantehormoner (54).
Til eksogene JA-applikationer behandles de tre bladstilke fra hver af de seks rosenblomstrende planter af hver art med 20 μl lanolinpasta indeholdende 150 μg MeJA (Lan + MeJA) og 20 μl lanolin plus sårbehandling (Lan + W), eller der anvendes 20 μl ren lanolin som kontrol. Bladene blev høstet 72 timer efter behandlingen, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 °C indtil brug.
Fire transgene JA- og ET-linjer, nemlig irAOC (36), irCOI1 (55), irACO og sETR1 (48), er blevet identificeret i vores forskningsgruppe. irAOC viste et stærkt fald i JA- og JA-Ile-niveauer, mens irCOI1 ikke var følsom over for JA'er. Sammenlignet med EV steg JA-Ile-akkumuleringen. Tilsvarende vil irACO reducere produktionen af ​​ET, og sammenlignet med EV vil sETR1, som er ufølsom over for ET, øge produktionen af ​​ET.
Et fotoakustisk laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 realtids-ET-sensor) bruges til at udføre ET-måling ikke-invasivt. Umiddelbart efter behandlingen blev halvdelen af ​​bladene skåret og overført til et 4 ml forseglet glasflaske, og luften i toppen fik lov til at akkumulere sig inden for 5 timer. Under målingen blev hvert glas skyllet med en strøm på 2 liter/time ren luft i 8 minutter, som forinden var passeret gennem en katalysator leveret af Sensor Sense for at fjerne CO2 og vand.
Mikroarray-dataene blev oprindeligt offentliggjort i (35) og gemt i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (tilgangsnummer GSE30287). Data svarende til bladene forårsaget af W + OSM-behandlingen og den ubeskadigede kontrol blev udtrukket til dette studie. Den rå intensitet er log2. Før statistisk analyse blev baseline konverteret og normaliseret til dens 75. percentil ved hjælp af R-softwarepakken.
De originale RNA-sekventeringsdata (RNA-seq) for Nicotiana-arter blev hentet fra NCBI Short Reading Archives (SRA), projektnummeret er PRJNA301787, som blev rapporteret af Zhou et al. (39) og fortsættes som beskrevet i (56). De rådata, der blev behandlet af W + W, W + OSM og W + OSS1 svarende til Nicotiana-arter, blev udvalgt til analyse i dette studie og behandlet på følgende måde: Først blev de rå RNA-seq-aflæsninger konverteret til FASTQ-format. HISAT2 konverterer FASTQ til SAM, og SAMtools konverterer SAM-filer til sorterede BAM-filer. StringTie bruges til at beregne genekspression, og dens ekspressionsmetode er, at der er fragmenter pr. tusinde basefragmenter pr. million sekventerede transkriptionsfragmenter.
Acclaim-kromatografikolonnen (150 mm x 2,1 mm; partikelstørrelse 2,2 μm), der anvendes i analysen, og 4 mm x 4 mm beskyttelseskolonnen består af samme materiale. Følgende binære gradient anvendes i Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)-systemet: 0 til 0,5 minutter, isokratisk 90 % A [deioniseret vand, 0,1 % (v/v) acetonitril og 0,05 % myresyre], 10 % B (acetonitril og 0,05 % myresyre); 0,5 til 23,5 minutter, gradientfasen er henholdsvis 10 % A og 90 % B; 23,5 til 25 minutter, isokratisk 10 % A og 90 % B. Flowhastigheden er 400 μl/min. For alle MS-analyser injiceres kolonneluenten i en quadrupol- og time-of-flight (qTOF)-analysator udstyret med en elektrospraykilde, der opererer i positiv ioniseringstilstand (kapillærspænding, 4500 V; kapillærudløb 130 V; tørretemperatur 200 °C; tørreluftstrøm 10 liter/min).
Udfør MS/MS-fragmentanalyse (herefter benævnt MS/MS), der er irrelevant eller umulig at skelne fra dataene, for at opnå strukturel information om den samlede detekterbare metaboliske profil. Konceptet bag den vilkårlige MS/MS-metode er baseret på, at kvadrupolen har et meget stort masseisolationsvindue [betragt derfor alle masse-til-ladningsforholdssignaler (m/z) som fragmenter]. Af denne grund, fordi Impact II-instrumentet ikke var i stand til at skabe en CE-hældning, blev der udført flere uafhængige analyser ved hjælp af øgede kollisionsinducerede dissociationskollisionsenergiværdier (CE). Kort sagt, analyser først prøven ved hjælp af UHPLC-elektrosprayionisering/qTOF-MS ved hjælp af enkelt massespektrometritilstand (lavfragmenteringsforhold genereret af fragmentering i kilden), scanning fra m/z 50 til 1500 ved en gentagelsesfrekvens på 5 Hz. Brug nitrogen som kollisionsgas til MS/MS-analyse, og udfør uafhængige målinger ved de følgende fire forskellige kollisionsinducerede dissociationsspændinger: 20, 30, 40 og 50 eV. Gennem hele måleprocessen har kvadrupolen det største masseisolationsvindue, fra m/z 50 til 1500. Når forkroppens m/z og isolationsbreddeforsøg er indstillet til 200, aktiveres masseområdet automatisk af instrumentets operativsystemsoftware og 0 Da. Scan for massefragmenter som i enkeltmassetilstand. Brug natriumformiat (50 ml isopropanol, 200 μl myresyre og 1 ml 1M NaOH vandig opløsning) til massekalibrering. Ved hjælp af Brukers højpræcisionskalibreringsalgoritme kalibreres datafilen efter at have kørt gennemsnitsspektret i en given tidsperiode. Brug eksportfunktionen i Data Analysis v4.0-softwaren (Brook Dalton, Bremen, Tyskland) til at konvertere de rå datafiler til NetCDF-format. MS/MS-datasættet er blevet gemt i den åbne metabolomikdatabase MetaboLights (www.ebi.ac.uk) med accessionsnummeret MTBLS1471.
MS/MS-assembling kan realiseres gennem korrelationsanalyse mellem MS1- og MS/MS-kvalitetssignaler for lav og høj kollisionsenergi og nyligt implementerede regler. R-scriptet bruges til at realisere korrelationsanalysen af ​​fordelingen af ​​forløberen til produktet, og C#-scriptet (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) bruges til at implementere reglerne.
For at reducere falsk positive fejl forårsaget af baggrundsstøj og falsk korrelation forårsaget af detektering af visse m/z-funktioner i kun få prøver, bruger vi funktionen "filled peak" i R-pakken XCMS (til korrektion af baggrundsstøj). Denne funktion bør bruges til at erstatte "NA"-intensiteten (undetected peak). Når fill peak-funktionen bruges, er der stadig mange "0"-intensitetsværdier i datasættet, som vil påvirke korrelationsberegningen. Derefter sammenligner vi databehandlingsresultaterne opnået, når den filled peak-funktion bruges, og når den filled peak-funktion ikke bruges, og beregner baggrundsstøjværdien baseret på den gennemsnitlige korrigerede estimerede værdi, og erstatter derefter disse 0-intensitetsværdier med den beregnede baggrundsværdi. Vi overvejede også kun funktioner, hvis intensitet oversteg tre gange baggrundsværdien, og betragtede dem som "sande toppe". Til PCC-beregninger tages kun m/z-signalerne fra prøveforløberen (MS1) og fragmentdatasættene med mindst otte sande toppe i betragtning.
Hvis intensiteten af ​​prækursorkvalitetsegenskaben i hele prøven er signifikant korreleret med den reducerede intensitet af den samme kvalitetsegenskab, der udsættes for lav eller høj kollisionsenergi, og egenskaben ikke er mærket som en isotoptop af CAMERA, kan den defineres yderligere. Ved derefter at beregne alle mulige prækursor-produkt-par inden for 3 sekunder (det estimerede retentionstidsvindue for peakretention) udføres korrelationsanalysen. Kun når m/z-værdien er lavere end prækursorværdien, og MS/MS-fragmentering forekommer på samme prøveplacering i datasættet som den prækursor, den er afledt af, betragtes den som et fragment.
Baseret på disse to enkle regler udelukker vi de specificerede fragmenter med m/z-værdier, der er større end m/z for den identificerede precursor, og baseret på prøvepositionen, hvor precursoren optræder, og det specificerede fragment. Det er også muligt at vælge de kvalitetsfunktioner, der genereres af mange in-source-fragmenter genereret i MS1-tilstand, som kandidatprecursorer og derved generere redundante MS/MS-forbindelser. For at reducere denne dataredundans, vil vi, hvis NDP-ligheden af ​​spektrene overstiger 0,6, og de tilhører kromatogrammet "pcgroup", der er annoteret af CAMERA, fusionere dem. Endelig fusionerer vi alle fire CE-resultater forbundet med precursoren og fragmenterne i det endelige dekonvolverede sammensatte spektrum ved at vælge den højeste intensitetstop blandt alle kandidattoppe med den samme m/z-værdi ved forskellige kollisionsenergier. De efterfølgende behandlingstrin er baseret på konceptet med sammensat spektrum og tager højde for de forskellige CE-betingelser, der kræves for at maksimere sandsynligheden for fragmentering, fordi nogle fragmenter kun kan detekteres under en specifik kollisionsenergi.
RDPI (30) blev anvendt til at beregne inducerbarheden af ​​den metaboliske profil. Den metaboliske spektrumdiversitet (Hj-indeks) er afledt af forekomsten af ​​MS/MS-forløbere ved hjælp af Shannon-entropien af ​​MS/MS-frekvensfordelingen ved hjælp af følgende ligning beskrevet af Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) hvor Pij svarer til den relative frekvens af den i-te MS/MS i den j-te prøve (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolisk specificitet (Si-indeks) er defineret som ekspressionsidentiteten af ​​en given MS/MS i forhold til hyppigheden mellem de prøver, der betragtes. MS/MS-specificitet beregnes som Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Brug følgende formel til at måle det metabolomspecifikke δj-indeks for hver j-prøve og gennemsnittet af MS/MS-specificiteten δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektre justeres parvis, og ligheden beregnes ud fra de to scorer. Først, ved hjælp af standard NDP (også kendt som cosinuskorrelationsmetode), bruges følgende ligning til at score segmentligheden mellem spektrene: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 hvor S1 og S2. Tilsvarende, for spektrum 1 og spektrum 2, såvel som WS1, i og WS2, repræsenterer i vægten baseret på peakintensiteten, hvor forskellen mellem den i-te fælles top mellem de to spektre er mindre end 0,01 Da. Vægten beregnes som følger: W = [peakintensitet] m [kvalitet] n, m = 0,5, n = 2, som foreslået af MassBank.
En anden scoringsmetode blev implementeret, som involverede analyse af den delte NL mellem MS/MS. Til dette formål brugte vi de 52 NL-lister, der ofte forekommer under MS-fragmenteringsprocessen, i tandem, og den mere specifikke NL (datafil S1), der tidligere er blevet annoteret for MS/MS-spektret af de sekundære metabolitter af den svækkede Nepenthes-art (9, 26). Opret en binær vektor på 1 og 0 for hver MS/MS, svarende til henholdsvis den nuværende og ikke-eksisterende af nogle NL. Baseret på den euklidiske afstandslighed beregnes NL-lighedsscoren for hvert par af binære NL-vektorer.
For at udføre dobbelt klyngedannelse brugte vi R-pakken DiffCoEx, som er baseret på en udvidelse af Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Ved hjælp af NDP- og NL-scoringsmatricerne fra MS/MS-spektre brugte vi DiffCoEx til at beregne den sammenlignende korrelationsmatrix. Binær klyngedannelse udføres ved at indstille parameteren "cutreeDynamic" til method = "hybrid", cutHeight = 0,9999, deepSplit = T og minClusterSize = 10. R-kildekoden til DiffCoEx blev downloadet fra den yderligere fil 1 af Tesson et al. (57); Den nødvendige R WGCNA-softwarepakke kan findes på https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
For at udføre MS/MS molekylær netværksanalyse beregnede vi parret spektral konnektivitet baseret på NDP- og NL-lighedstyper og brugte Cytoscape-software til at visualisere netværkstopologi ved hjælp af organisk layout i CyFilescape yFiles layoutalgoritmeudvidelsesapplikationen.
Brug R version 3.0.1 til at udføre statistisk analyse af dataene. Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af tovejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Tukey's Honesty Significant Difference (HSD) post-hoc test. For at analysere forskellen mellem den planteædende behandling og kontrolgruppen blev den tosidede fordeling af de to grupper af prøver med samme varians analyseret ved hjælp af Student's t-test.
For supplerende materiale til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillader brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, så længe den endelige anvendelse ikke er til kommerciel gevinst, og forudsætningen er, at det originale værk er korrekt. Reference.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at den ikke er spam. Vi indsamler ikke nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende, og til at forhindre automatisk spamindsendelse.
Informationsteori giver en universel valuta til sammenligning af specielle metabolomer og forudsigelse af testforsvarsteorier.
Informationsteori giver en universel valuta til sammenligning af specielle metabolomer og forudsigelse af testforsvarsteorier.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheder forbeholdes. AAAS er partner med HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.