Artiklen er en del af forskningsemnet “Forbedring af bælgplanters resistens over for patogener og skadedyr”, se alle 5 artikler
Den forårsagende agens for svampesygdommen nekrose hos planter, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, anvender en flerlagsstrategi til at inficere forskellige værtsplanter. Denne undersøgelse foreslår brugen af ​​diaminen L-ornithin, en ikke-proteinaminosyre, der stimulerer syntesen af ​​andre essentielle aminosyrer, som en alternativ håndteringsstrategi til at forbedre de molekylære, fysiologiske og biokemiske reaktioner hos Phaseolus vulgaris L. på hvid skimmel forårsaget af Pseudomonas sclerotiorum. In vitro-eksperimenter viste, at L-ornithin signifikant hæmmede mycelievæksten af ​​S. pyrenoidosa på en dosisafhængig måde. Desuden kunne det reducere sværhedsgraden af ​​hvid skimmel signifikant under drivhusforhold. Ydermere stimulerede L-ornithin væksten af ​​de behandlede planter, hvilket indikerer, at de testede koncentrationer af L-ornithin ikke var fytotoksiske for de behandlede planter. Derudover forstærkede L-ornithin ekspressionen af ​​ikke-enzymatiske antioxidanter (totale opløselige fenoler og flavonoider) og enzymatiske antioxidanter (katalase (CAT), peroxidase (POX) og polyphenoloxidase (PPO)) og øgede ekspressionen af ​​tre antioxidantrelaterede gener (PvCAT1, PvSOD og PvGR). Ydermere afslørede in silico-analyse tilstedeværelsen af ​​et formodet oxaloacetatacetylhydrolase (SsOAH)-protein i S. sclerotiorum-genomet, som var meget lig oxaloacetatacetylhydrolase (SsOAH)-proteinerne fra Aspergillus fijiensis (AfOAH) og Penicillium sp. (PlOAH) med hensyn til funktionel analyse, konserverede domæner og topologi. Interessant nok reducerede tilsætningen af ​​L-ornithin til kartoffeldextrosebouillon (PDB)-medium signifikant ekspressionen af ​​SsOAH-genet i S. sclerotiorum-mycelier. Tilsvarende reducerede eksogen tilførsel af L-ornithin signifikant ekspressionen af ​​SsOAH-genet i svampemycelier indsamlet fra behandlede planter. Endelig reducerede L-ornithin-tilførsel signifikant oxalsyresekretionen i både PDB-medium og inficerede blade. Afslutningsvis spiller L-ornithin en nøglerolle i at opretholde redoxstatus samt forbedre forsvarsresponset hos inficerede planter. Resultaterne af denne undersøgelse kan bidrage til at udvikle innovative, miljøvenlige metoder til at bekæmpe hvid skimmelsvamp og afbøde dens indvirkning på bønneproduktion og andre afgrøder.
Hvid skimmelsvamp, forårsaget af den nekrotrofiske svamp Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, er en ødelæggende, udbyttedæmpende sygdom, der udgør en alvorlig trussel mod den globale bønneproduktion (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum er en af ​​de vanskeligste jordbårne svampepatogener at bekæmpe, med en bred værtsgruppe på over 600 plantearter og evnen til hurtigt at macerere værtsvæv på en ikke-specifik måde (Liang og Rollins, 2018). Under ugunstige forhold gennemgår den en kritisk fase af sin livscyklus, hvor den forbliver i dvale i lange perioder som sorte, hårde, frølignende strukturer kaldet 'sklerotier' i jorden eller som hvide, luftige vækster i myceliet eller stængelmarven på inficerede planter (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum er i stand til at danne sklerotier, hvilket gør det muligt for den at overleve i inficerede marker i lange perioder og at fortsætte under sygdom (Schwartz et al., 2005). Sklerotier er rige på næringsstoffer, kan overleve i jorden i lange perioder og tjene som det primære inokulum for efterfølgende infektioner (Schwartz et al., 2005). Under gunstige forhold spirer sklerotier og producerer luftbårne sporer, der kan inficere alle overjordiske dele af planten, herunder, men ikke begrænset til, blomster, stængler eller bælge (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum bruger en flerlagsstrategi til at inficere sine værtsplanter, der involverer en række koordinerede begivenheder fra sklerotiel spiring til symptomudvikling. I starten producerer S. sclerotiorum suspenderede sporer (kaldet ascosporer) fra svampelignende strukturer kaldet apotheker, som bliver luftbårne og udvikler sig til ikke-bevægelige sklerotier på inficeret planteaffald (Bolton et al., 2006). Svampen udskiller derefter oxalsyre, en virulensfaktor, for at kontrollere plantens cellevægs pH-værdi, fremme enzymatisk nedbrydning og vævsinvasion (Hegedus og Rimmer, 2005) og undertrykke værtsplantens oxidative udbrud. Denne forsuringsproces svækker plantens cellevæg og giver et gunstigt miljø for normal og effektiv drift af svampecellevægsnedbrydende enzymer (CWDE'er), hvilket gør det muligt for patogenet at overvinde den fysiske barriere og trænge ind i værtsvævet (Marciano et al., 1983). Når S. sclerotiorum er penetreret, udskiller den en række CWDE'er, såsom polygalacturonase og cellulase, som letter dens spredning i inficeret væv og forårsager vævsnekrose. Udviklingen af ​​læsioner og hyfemåtter fører til de karakteristiske symptomer på hvidskimmel (Hegedus og Rimmer, 2005). I mellemtiden genkender værtsplanter patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er) gennem mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er), hvilket udløser en række signalhændelser, der i sidste ende aktiverer forsvarsresponser.
Trods årtiers sygdomsbekæmpelsesindsats er der fortsat mangel på tilstrækkeligt resistent kimplasma i bønner, ligesom i andre kommercielle afgrøder, på grund af patogenets resistens, overlevelse og tilpasningsevne. Sygdomshåndtering er derfor ekstremt udfordrende og kræver en integreret, mangesidet strategi, der inkluderer en kombination af kulturpraksis, biologisk bekæmpelse og kemiske fungicider (O'Sullivan et al., 2021). Kemisk bekæmpelse af hvid skimmelsvamp er den mest effektive, fordi fungicider, når de anvendes korrekt og på det rigtige tidspunkt, effektivt kan kontrollere spredningen af ​​sygdommen, reducere infektionens sværhedsgrad og minimere udbyttetab. Overforbrug og overdreven afhængighed af fungicider kan dog føre til fremkomsten af ​​resistente stammer af S. sclerotiorum og have en negativ indvirkning på ikke-målorganismer, jordbundssundhed og vandkvalitet (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Derfor er det blevet en topprioritet at finde miljøvenlige alternativer.
Polyaminer (PA'er), såsom putrescin, spermidin, spermin og cadaverin, kan tjene som lovende alternativer mod jordbårne plantepatogener og derved helt eller delvist reducere brugen af ​​farlige kemiske fungicider (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). I højere planter er PA'er involveret i mange fysiologiske processer, herunder, men ikke begrænset til, celledeling, differentiering og respons på abiotiske og biotiske stressfaktorer (Killiny og Nehela, 2020). De kan fungere som antioxidanter, hjælpe med at opfange reaktive iltarter (ROS), opretholde redoxhomeostase (Nehela og Killiny, 2023), inducere forsvarsrelaterede gener (Romero et al., 2018), regulere forskellige metaboliske veje (Nehela og Killiny, 2023), modulere endogene fytohormoner (Nehela og Killiny, 2019), etablere systemisk erhvervet resistens (SAR) og regulere plante-patogen-interaktioner (Nehela og Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Det er værd at bemærke, at de specifikke mekanismer og roller for PA'er i planteforsvar varierer afhængigt af planteart, patogener og miljøforhold. Den mest udbredte PA i planter biosyntetiseres fra den essentielle polyamin L-ornithin (Killiny og Nehela, 2020).
L-ornithin spiller flere roller i planters vækst og udvikling. For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at ornithin i ris (Oryza sativa) kan være forbundet med nitrogengenbrug (Liu et al., 2018), risudbytte, kvalitet og aroma (Lu et al., 2020) samt vandstressrespons (Yang et al., 2000). Desuden forbedrede eksogen anvendelse af L-ornithin tørketolerancen betydeligt i sukkerroer (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) og lindrede saltstress i løgplanter (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu og Çavuşoǧlu, 2021) og cashewnødder (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). L-ornithins potentielle rolle i abiotisk stressforsvar kan skyldes dets involvering i prolinakkumulering i behandlede planter. For eksempel er gener relateret til prolinmetabolisme, såsom ornithin delta aminotransferase (delta-OAT) og prolin dehydrogenase (ProDH1 og ProDH2) gener, tidligere blevet rapporteret at være involveret i forsvaret af Nicotiana benthamiana og Arabidopsis thaliana mod ikke-vært Pseudomonas syringae-stammer (Senthil-Kumar og Mysore, 2012). På den anden side er svampe-ornithin decarboxylase (ODC) nødvendig for patogenvækst (Singh et al., 2020). Målretning af ODC af Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via værtsinduceret gensilencing (HIGS) øgede tomatplanters resistens over for Fusarium visnesyge betydeligt (Singh et al., 2020). Den potentielle rolle af eksogen ornithin-applikation mod biotiske stressfaktorer såsom fytopatogener er imidlertid ikke blevet grundigt undersøgt. Endnu vigtigere er det, at ornithins virkninger på sygdomsresistens og de tilhørende biokemiske og fysiologiske fænomener fortsat stort set uudforskede.
Det er vigtigt at forstå kompleksiteten af ​​S. sclerotiorum-infektion i bælgplanter for at udvikle effektive bekæmpelsesstrategier. I denne undersøgelse havde vi til formål at identificere den potentielle rolle af diaminen L-ornithin som en nøglefaktor i at forbedre bælgplanters forsvarsmekanismer og resistens over for Sclerotinia sclerotiorum-infektion. Vi antager, at L-ornithin, udover at forbedre forsvarsresponserne hos inficerede planter, også spiller en nøglerolle i at opretholde redoxstatus. Vi foreslår, at de potentielle virkninger af L-ornithin er relateret til reguleringen af ​​enzymatiske og ikke-enzymatiske antioxidante forsvarsmekanismer og interferens med svampepatogenicitets-/virulensfaktorer og tilhørende proteiner. Denne dobbelte funktionalitet af L-ornithin gør det til en lovende kandidat til en bæredygtig strategi til at afbøde virkningen af ​​hvid skimmel og forbedre resistensen hos almindelige bælgplanter over for dette potente svampepatogen. Resultaterne af denne undersøgelse kan bidrage til udviklingen af ​​innovative, miljøvenlige metoder til at bekæmpe hvid skimmel og afbøde dens indvirkning på bælgplanteproduktionen.
I denne undersøgelse blev en modtagelig kommerciel sort af almindelig bønne, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), anvendt som forsøgsmateriale. Sunde frø blev venligst leveret af Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypten. Fem frø blev sået i plastikpotter (indre diameter 35 cm, dybde 50 cm) fyldt med S. sclerotiorum-inficeret jord under drivhusforhold (25 ± 2 °C, relativ luftfugtighed 75 ± 1%, 8 timer lys/16 timer mørke). 7-10 dage efter såning (DPS) blev kimplanterne udtyndet, så der kun var to kimplanter med ensartet vækst og tre fuldt udviklede blade i hver potte. Alle potteplanter blev vandet en gang hver anden uge og gødet månedligt med den anbefalede mængde for den givne sort.
For at fremstille en koncentration på 500 mg/L af L-ornithindiamin (også kendt som (+)-(S)-2,5-diaminopentansyre; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) blev 50 mg først opløst i 100 ml sterilt destilleret vand. Stamopløsningen blev derefter fortyndet og anvendt i efterfølgende eksperimenter. Kort fortalt blev seks serier af L-ornithin-koncentrationer (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) testet in vitro. Derudover blev sterilt destilleret vand anvendt som negativ kontrol (Mock), og det kommercielle fungicid "Rizolex-T" 50% befugteligt pulver (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypten) blev anvendt som positiv kontrol. Det kommercielle fungicid “Rizolex-T” blev testet in vitro ved fem koncentrationer (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L).
Prøver af almindelige bønnestængler og bælge, der viste typiske symptomer på hvid skimmelsvamp (angrebsrate: 10-30%), blev indsamlet fra kommercielle landbrug. Selvom det meste af det inficerede plantemateriale blev identificeret efter art/sort (modtagelig kommerciel sort Giza 3), var andre, især dem, der blev erhvervet fra lokale markeder, af ukendt art. De indsamlede inficerede materialer blev først overfladedesinficeret med 0,5% natriumhypochloritopløsning i 3 minutter, derefter skyllet flere gange med sterilt destilleret vand og tørret med sterilt filterpapir for at fjerne overskydende vand. De inficerede organer blev derefter skåret i små stykker fra det midterste væv (mellem sundt og inficeret væv), dyrket på kartoffeldextroseagar (PDA)-medium og inkuberet ved 25 ± 2 °C med en 12 timers lys/12 timers mørkecyklus i 5 dage for at stimulere dannelsen af ​​sklerotier. Myceliespidsmetode blev også brugt til at oprense svampeisolater fra blandede eller kontaminerede kulturer. Det oprensede svampeisolat blev først identificeret baseret på dets kulturelle morfologiske karakteristika og derefter bekræftet at være S. sclerotiorum baseret på mikroskopiske træk. Endelig blev alle oprensede isolater testet for patogenicitet på den modtagelige almindelige bønnekultivar Giza 3 for at opfylde Kochs postulater.
Derudover blev det mest invasive S. sclerotiorum-isolat (isolat #3) yderligere bekræftet baseret på intern transkriberet spacer (ITS)-sekventering som beskrevet af White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kort fortalt blev isolaterne dyrket i kartoffeldextrosebouillon (PDB) og inkuberet ved 25 ± 2 °C i 5-7 dage. Svampemycelium blev derefter opsamlet, filtreret gennem ostelærred, vasket to gange med sterilt vand og tørret med sterilt filterpapir. Genomisk DNA blev isoleret ved hjælp af Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNA-regionen blev derefter amplificeret ved hjælp af det specifikke primerpar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; forventet størrelse: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). De oprensede PCR-produkter blev indsendt til sekventering (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA-sekvenserne blev sekventeret tovejs ved hjælp af Sanger-sekventeringsmetoden. De samlede forespørgselssekvenser blev derefter sammenlignet med de seneste data i GenBank og National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ved hjælp af BLASTn-software. Forespørgselssekvensen blev sammenlignet med 20 andre S. sclerotiorum-stammer/isolater hentet fra de seneste data i NCBI GenBank (Supplerende Tabel S1) ved hjælp af ClustalW i Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; version 11) (Kumar et al., 2024). Evolutionær analyse blev udført ved hjælp af maximum likelihood-metoden og den generelle tidsreversible nukleotidsubstitutionsmodel (Nei og Kumar, 2000). Træet med den højeste log-sandsynlighed er vist. Det indledende træ til den heuristiske søgning er valgt ved at vælge træet med den højeste log-sandsynlighed mellem neighbor-joining (NJ) træet (Kumar et al., 2024) og maximum parsimony (MP) træet. NJ-træet blev konstrueret ved hjælp af en parvis afstandsmatrix beregnet ved hjælp af den generelle tidsreversible model (Nei og Kumar, 2000).
Den antibakterielle aktivitet af L-ornithin og baktericidet "Rizolex-T" blev bestemt in vitro ved agardiffusionsmetoden. Metode: Tag den passende mængde af stamopløsningen af ​​L-ornithin (500 mg/L) og bland den grundigt med 10 ml af PDA-næringsmediet for at fremstille opløsninger med slutkoncentrationer på henholdsvis 12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L. Fem koncentrationer af fungicidet "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L) og sterilt destilleret vand blev anvendt som kontrol. Efter at mediet var størknet, blev en frisk fremstillet mycelieprop af Sclerotinia sclerotiorum-kultur, 4 mm i diameter, overført til midten af ​​petriskålen og dyrket ved 25 ± 2 °C, indtil myceliet dækkede hele kontrol-petriskålen, hvorefter svampevæksten blev registreret. Beregn den procentvise hæmning af radial vækst af S. sclerotiorum ved hjælp af ligning 1:
Eksperimentet blev gentaget to gange med seks biologiske replikater for hver kontrol-/eksperimentelgruppe og fem potter (to planter pr. potte) for hvert biologisk replikat. Hvert biologisk replikat blev analyseret to gange (to tekniske replikater) for at sikre nøjagtigheden, pålideligheden og reproducerbarheden af ​​de eksperimentelle resultater. Derudover blev probit-regressionsanalyse anvendt til at beregne den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) og IC99 (Prentice, 1976).
For at evaluere potentialet af L-ornithin under drivhusforhold blev der udført to på hinanden følgende potteforsøg. Kort fortalt blev potterne fyldt med steriliseret ler-sandjord (3:1) og inokuleret med en frisk fremstillet kultur af S. sclerotiorum. Først blev det mest invasive isolat af S. sclerotiorum (isolat #3) dyrket ved at skære en sclerotium i halve, placere den med forsiden nedad på en PDA og inkubere ved 25 °C i konstant mørke (24 timer) i 4 dage for at stimulere mycelievækst. Fire agarpropper med en diameter på 5 mm blev derefter taget fra forkanten og inokuleret med 100 g af en steril blanding af hvede- og risklid (1:1, v/v), og alle kolber blev inkuberet ved 25 ± 2 °C under en 12 timers lys/12 timers mørkecyklus i 5 dage for at stimulere dannelsen af ​​sclerotier. Indholdet af alle kolber blev grundigt blandet for at sikre homogenitet, før jord blev tilsat. Derefter blev 100 g af den koloniserende klidblanding tilsat hver potte for at sikre en konstant koncentration af patogener. De podede potter blev vandet for at aktivere svampevækst og placeret i drivhusforhold i 7 dage.
Fem frø af Giza 3-sorten blev derefter sået i hver potte. For potterne behandlet med L-ornithin og fungicidet Rizolex-T blev de steriliserede frø først gennemblødt i to timer i en vandig opløsning af de to forbindelser med en endelig IC99-koncentration på henholdsvis ca. 250 mg/L og 50 mg/L og derefter lufttørret i en time før såning. Frøene blev derimod gennemblødt i sterilt destilleret vand som negativ kontrol. Efter 10 dage, før den første vanding, blev kimplanterne tyndet ud, så der kun var to pæne kimplanter i hver potte. For at sikre infektion med S. sclerotiorum blev derudover skåret stængler af bønneplanter på samme udviklingsstadium (10 dage) over på to forskellige steder med en steriliseret skalpel, og ca. 0,5 g af den koloniserende klidblanding blev placeret i hvert sår, efterfulgt af høj luftfugtighed for at stimulere infektion og sygdomsudvikling i alle podede planter. Kontrolplanter blev såret på lignende måde, og en lige stor mængde (0,5 g) steril, ukoloniseret klidblanding blev anbragt i såret og opbevaret under høj luftfugtighed for at simulere miljøet for sygdomsudvikling og sikre konsistens mellem behandlingsgrupperne.
Behandlingsmetode: Bønneplanter blev vandet med 500 ml af en vandig opløsning af L-ornithin (250 mg/l) eller fungicidet Rizolex-T (50 mg/l) ved at vande jorden, hvorefter behandlingen blev gentaget tre gange med 10 dages mellemrum. De placebobehandlede kontrolpersoner blev vandet med 500 ml sterilt destilleret vand. Alle behandlinger blev udført under drivhusforhold (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relativ luftfugtighed og en fotoperiode på 8 timer lys/16 timer mørke). Alle potter blev vandet hver fjortende dag og behandlet månedligt med en afbalanceret NPK-gødning (20-20-20, med 3,6 % svovl og TE-mikroelementer; Zain Seeds, Egypten) i en koncentration på 3-4 g/l ved bladsprøjtning i henhold til anbefalingerne for den specifikke sort og producentens instruktioner. Medmindre andet er angivet, blev fuldt ekspanderede modne blade (2. og 3. blade fra toppen) indsamlet fra hvert biologisk replikat 72 timer efter behandling (hpt), homogeniseret, samlet og opbevaret ved -80 °C til yderligere analyser, herunder, men ikke begrænset til, in situ histokemisk lokalisering af oxidative stressindikatorer, lipidperoxidation, enzymatiske og ikke-enzymatiske antioxidanter og genekspression.
Intensiteten af ​​hvidskimmelinfektion blev vurderet ugentligt 21 dage efter podning (dpi) ved hjælp af en skala fra 1-9 (Supplerende Tabel S2) baseret på Petzoldt og Dickson-skalaen (1996) modificeret af Teran et al. (2006). Kort fortalt blev stængler og grene af bønneplanter undersøgt startende ved podningspunktet for at følge progressionen af ​​læsioner langs internoder og knuder. Afstanden fra læsionen fra podningspunktet til det fjerneste punkt langs stilken eller grenen blev derefter målt, og en score på 1-9 blev tildelt baseret på læsionens placering, hvor (1) indikerede ingen synlig infektion nær podningspunktet, og (2-9) indikerede en gradvis stigning i læsionsstørrelse og progression langs knuder/internoder (Supplerende Tabel S2). Intensiteten af ​​hvidskimmelinfektion blev derefter konverteret til procentdel ved hjælp af formel 2:
Derudover blev arealet under sygdomsprogressionskurven (AUDPC) beregnet ved hjælp af formlen (Shaner og Finney, 1977), som for nylig blev tilpasset til hvid råd hos almindelige bønner (Chauhan et al., 2020) ved hjælp af ligning 3:
Hvor Yi = sygdommens sværhedsgrad på tidspunktet ti, Yi+1 = sygdommens sværhedsgrad på næste tidspunkt ti+1, ti = tidspunktet for første måling (i dage), ti+1 = tidspunktet for næste måling (i dage), n = det samlede antal tidspunkter eller observationspunkter. Vækstparametre for bønneplanter, herunder plantehøjde (cm), antal grene pr. plante og antal blade pr. plante, blev registreret ugentligt i 21 dage i alle biologiske replikater.
I hvert biologisk replikat blev bladprøver (andet og tredje fuldt udviklede blade fra toppen) indsamlet på dag 45 efter behandling (15 dage efter den sidste behandling). Hvert biologisk replikat bestod af fem potter (to planter pr. potte). Omkring 500 mg af det knuste væv blev brugt til ekstraktion af fotosyntetiske pigmenter (klorofyl a, klorofyl b og carotenoider) ved anvendelse af 80% acetone ved 4 °C i mørke. Efter 24 timer blev prøverne centrifugeret, og supernatanten blev indsamlet til bestemmelse af klorofyl a, klorofyl b og carotenoidindhold kolorimetrisk ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) i henhold til metoden fra (Lichtenthaler, 1987) ved at måle absorbansen ved tre forskellige bølgelængder (A470, A646 og A663 nm). Endelig blev indholdet af fotosyntetiske pigmenter beregnet ved hjælp af følgende formler 4-6 beskrevet af Lichtenthaler (1987).
72 timer efter behandling (hpt) blev blade (andet og tredje fuldt udviklede blade fra toppen) indsamlet fra hvert biologisk replikat til in situ histokemisk lokalisering af hydrogenperoxid (H2O2) og superoxidanion (O2•−). Hvert biologisk replikat bestod af fem potter (to planter pr. potte). Hvert biologisk replikat blev analyseret i duplikat (to tekniske replikater) for at sikre metodens nøjagtighed, pålidelighed og reproducerbarhed. H2O2 og O2•− blev bestemt ved hjælp af henholdsvis 0,1% 3,3'-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) eller nitroblåt tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) efter metoderne beskrevet af Romero-Puertas et al. (2004) og Adam et al. (1989) med mindre ændringer. Til histokemisk lokalisering af H2O2 in situ blev småbladene vakuuminfiltreret med 0,1% DAB i 10 mM Tris-buffer (pH 7,8) og derefter inkuberet ved stuetemperatur i lys i 60 minutter. Småbladene blev bleget i 0,15% (v/v) TCA i 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypten) og derefter udsat for lys, indtil de blev mørkere. Tilsvarende blev klapperne vakuuminfiltreret med 10 mM kaliumphosphatbuffer (pH 7,8) indeholdende 0,1 w/v % HBT til histokemisk lokalisering af O2•− in situ. Småbladene blev inkuberet i lys ved stuetemperatur i 20 minutter, derefter bleget som ovenfor og derefter belyst, indtil mørkeblå/violette pletter fremkom. Intensiteten af ​​den resulterende brune (som en H2O2-indikator) eller blåviolette (som en O2•−-indikator) farve blev vurderet ved hjælp af Fiji-versionen af ​​billedbehandlingspakken ImageJ (http://fiji.sc; tilgået 7. marts 2024).
Malondialdehyd (MDA; som markør for lipidperoxidation) blev bestemt i henhold til Du og Bramlages metode (1992) med små ændringer. Blade fra hvert biologisk replikat (andet og tredje fuldt udviklede blade fra toppen) blev indsamlet 72 timer efter behandling (hpt). Hvert biologisk replikat omfattede fem potter (to planter pr. potte). Hvert biologisk replikat blev analyseret i duplikat (to tekniske replikater) for at sikre metodens nøjagtighed, pålidelighed og reproducerbarhed. Kort fortalt blev 0,5 g formalet bladvæv anvendt til MDA-ekstraktion med 20% trichloreddikesyre (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) indeholdende 0,01% butyleret hydroxytoluen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). MDA-indholdet i supernatanten blev derefter bestemt kolorimetrisk ved at måle absorbansen ved 532 og 600 nm ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) og derefter udtrykt som nmol g−1 FW.
Til vurdering af ikke-enzymatiske og enzymatiske antioxidanter blev blade (andet og tredje fuldt udviklede blade fra toppen) indsamlet fra hvert biologisk replikat 72 timer efter behandling (hpt). Hvert biologisk replikat bestod af fem potter (to planter pr. potte). Hver biologisk prøve blev analyseret i duplikat (to tekniske prøver). To blade blev formalet med flydende nitrogen og anvendt direkte til bestemmelse af enzymatiske og ikke-enzymatiske antioxidanter, totale aminosyrer, prolinindhold, genekspression og oxalatkvantificering.
Totalt indhold af opløselige fenoler blev bestemt ved hjælp af Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med små ændringer af metoden beskrevet af Kahkonen et al. (1999). Kort fortalt blev ca. 0,1 g homogeniseret bladvæv ekstraheret med 20 ml 80% methanol i mørke i 24 timer, og supernatanten blev opsamlet efter centrifugering. 0,1 ml af prøveekstraktet blev blandet med 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10%), rystet i 30 sekunder og efterladt i mørke i 5 minutter. Derefter blev 0,5 ml 20% natriumcarbonatopløsning (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypten) tilsat hvert rør, blandet grundigt og inkuberet ved stuetemperatur i mørke i 1 time. Efter inkubation blev reaktionsblandingens absorbans målt ved 765 nm ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentrationen af ​​totale opløselige fenoler i prøveekstrakterne blev bestemt ved hjælp af en gallussyrekalibreringskurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) og udtrykt som milligram gallussyreækvivalent pr. gram frisk vægt (mg GAE g-1 frisk vægt).
Det samlede indhold af opløselige flavonoider blev bestemt i henhold til metoden fra Djeridane et al. (2006) med små ændringer. Kort fortalt blev 0,3 ml af ovenstående metanolekstrakt blandet med 0,3 ml 5% aluminiumchloridopløsning (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), kraftigt omrørt og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter, efterfulgt af tilsætning af 0,3 ml 10% kaliumacetatopløsning (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypten), grundigt blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Efter inkubation blev reaktionsblandingens absorbans målt ved 430 nm ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentrationen af ​​totale opløselige flavonoider i prøveekstrakter blev bestemt ved hjælp af en rutinkalibreringskurve (TCI America, Portland, OR, USA) og derefter udtrykt som milligram rutinækvivalent pr. gram frisk vægt (mg RE g-1 frisk vægt).
Det samlede indhold af frie aminosyrer i bønneblade blev bestemt ved hjælp af et modificeret ninhydrinreagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) baseret på metoden foreslået af Yokoyama og Hiramatsu (2003) og modificeret af Sun et al. (2006). Kort fortalt blev 0,1 g formalet væv ekstraheret med pH 5,4 buffer, og 200 μL af supernatanten blev reageret med 200 μL ninhydrin (2%) og 200 μL pyridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkuberet i et kogende vandbad i 30 minutter, derefter afkølet og målt ved 580 nm ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). På den anden side blev prolin bestemt ved Bates-metoden (Bates et al., 1973). Prolin blev ekstraheret med 3% sulfosalicylsyre (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA), og efter centrifugering blev 0,5 ml af supernatanten blandet med 1 ml iseddike (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) og ninhydrinreagens, inkuberet ved 90°C i 45 minutter, afkølet og målt ved 520 nm ved hjælp af det samme spektrofotometer som ovenfor. Totale frie aminosyrer og prolin i bladekstrakterne blev bestemt ved hjælp af henholdsvis glycin- og prolinkalibreringskurver (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og udtrykt som mg/g friskvægt.
For at bestemme den enzymatiske aktivitet af antioxidantenzymer blev cirka 500 mg homogeniseret væv ekstraheret med 3 ml 50 mM Tris-buffer (pH 7,8) indeholdende 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 7,5% polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugeret ved 10.000 × g i 20 minutter under køling (4 °C), og supernatanten (rå enzymekstrakt) blev opsamlet (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) blev derefter omsat med 2 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 100 μl 269 mM H2O2-opløsning for at bestemme dens enzymatiske aktivitet i henhold til Aebis metode (1984) med små ændringer (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiacol-afhængig peroxidase (POX) enzymatisk aktivitet blev bestemt ved hjælp af Harrach et al.s metode (2009). (2008) med mindre modifikationer (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), og den enzymatiske aktivitet af polyphenoloxidase (PPO) blev bestemt efter reaktion med 2,2 ml 100 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) og 100 μl 12 mM H2O2. Metoden blev en smule modificeret fra (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Assayet blev udført efter reaktion med 3 ml catecholopløsning (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) frisk fremstillet i 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,0). CAT-aktivitet blev målt ved at overvåge nedbrydningen af ​​H2O2 ved 240 nm (A240), POX-aktivitet blev målt ved at overvåge stigningen i absorbans ved 436 nm (A436), og PPO-aktivitet blev målt ved at registrere absorbansfluktuationer ved 495 nm (A495) hvert 30. sekund i 3 minutter ved hjælp af et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu, Japan).
Realtids-RT-PCR blev brugt til at detektere transkriptniveauerne af tre antioxidantrelaterede gener, herunder peroxisomal katalase (PvCAT1; GenBank-accessionsnr. KF033307.1), superoxiddismutase (PvSOD; GenBank-accessionsnr. XM_068639556.1) og glutathionreduktase (PvGR; GenBank-accessionsnr. KY195009.1), i bønneblade (det andet og tredje fuldt udviklede blad fra toppen) 72 timer efter den sidste behandling. Kort fortalt blev RNA isoleret ved hjælp af Simply P Total RNA Extraction Kit (katalognr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kina) i henhold til producentens protokol. Derefter blev cDNA syntetiseret ved hjælp af TOP script™ cDNA Synthesis Kit i henhold til producentens instruktioner. Primersekvenserne for de ovenstående tre gener er anført i supplerende tabel S3. PvActin-3 (GenBank-accessionsnummer: XM_068616709.1) blev anvendt som housekeeping-gen, og den relative genekspression blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden (Livak og Schmittgen, 2001). Actin-stabilitet under biotisk stress (uforenelig interaktion mellem almindelige bælgplanter og anthracnose-svampen Colletotrichum lindemuthianum) og abiotisk stress (tørke, saltindhold, lav temperatur) blev påvist (Borges et al., 2012).
Vi udførte indledningsvis en genomomfattende in silico-analyse af oxaloacetatacetylhydrolase (OAH)-proteiner i S. sclerotiorum ved hjælp af protein-protein BLAST-værktøjet (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kort fortalt brugte vi OAH fra Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxid: 1191702; GenBank-accessionsnummer XP_040799428.1; 342 aminosyrer) og Penicillium lagena (PlOAH; taxid: 94218; GenBank-accessionsnummer XP_056833920.1; 316 aminosyrer) som forespørgselssekvenser til at kortlægge det homologe protein i S. sclerotiorum (taxid: 5180). BLASTp blev udført mod de senest tilgængelige S. sclerotiorum-genomdata i GenBank på National Center for Biotechnology Information (NCBI) hjemmeside, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Derudover blev det forudsagte OAH-gen fra S. sclerotiorum (SsOAH) og den evolutionære analyse og det fylogenetiske træ af AfOAH fra A. fijiensis CBS 313.89 og PlOAH fra P. lagena udledt ved hjælp af maximum likelihood-metoden i MEGA11 (Tamura et al., 2021) og den JTT-matrixbaserede model (Jones et al., 1992). Det fylogenetiske træ blev kombineret med den multiple alignment-analyse af proteinsekvenser af alle forudsagte OAH-gener (SsOAH) fra S. sclerotiorum og forespørgselssekvensen ved hjælp af Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos og Agarwala, 2007). Derudover blev de bedst matchende aminosyresekvenser af SsOAH fra S. sclerotiorum justeret med forespørgselssekvenserne (AfOAH og PlOAH) (Larkin et al., 2007) ved hjælp af ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), og konserverede regioner i alignmenten blev visualiseret ved hjælp af ESPript-værktøjet (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Derudover blev de forudsagte funktionelle repræsentative domæner og konserverede steder for S. sclerotiorum SsOAH interaktivt klassificeret i forskellige familier ved hjælp af InterPro-værktøjet (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Endelig blev tredimensionel (3D) strukturmodellering af den forudsagte S. sclerotiorum SsOAH udført ved hjælp af Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) og valideret ved hjælp af SWISS-MODEL-serveren (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De forudsagte tredimensionelle strukturer (PDB-format) blev interaktivt visualiseret ved hjælp af UCSF-Chimera-pakken (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitativ realtidsfluorescens-PCR blev anvendt til at bestemme det transkriptionelle niveau af oxaloacetatacetylhydrolase (SsOAH; GenBank-accessionsnummer: XM_001590428.1) i myceliet fra Sclerotinia sclerotiorum. Kort fortalt blev S. sclerotiorum inokuleret i en kolbe indeholdende PDB og placeret i en rysteinkubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ved 25 ± 2 °C i 24 timer ved 150 rpm og i konstant mørke (24 timer) for at stimulere mycelievækst. Derefter blev cellerne behandlet med L-ornithin og fungicidet Rizolex-T ved endelige IC50-koncentrationer (henholdsvis ca. 40 og 3,2 mg/L) og derefter dyrket i yderligere 24 timer under de samme betingelser. Efter inkubation blev kulturerne centrifugeret ved 2500 rpm i 5 minutter, og supernatanten (svampemycelium) blev opsamlet til genekspressionsanalyse. Tilsvarende blev svampemycelium opsamlet 0, 24, 48, 72, 96 og 120 timer efter infektion fra inficerede planter, der havde dannet hvidskimmel og bomuldsmycelium på overfladen af ​​inficeret væv. RNA blev ekstraheret fra svampemyceliet, og derefter blev cDNA syntetiseret som beskrevet ovenfor. Primersekvenserne for SsOAH er anført i supplerende tabel S3. SsActin (GenBank-accessionsnummer: XM_001589919.1) blev anvendt som housekeeping-gen, og relativ genekspression blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden (Livak og Schmittgen, 2001).
Oxalsyre blev bestemt i kartoffeldextrosebouillon (PDB) og planteprøver indeholdende svampepatogenet Sclerotinia sclerotiorum i henhold til metoden fra Xu og Zhang (2000) med små ændringer. Kort fortalt blev S. sclerotiorum-isolater inokuleret i kolber indeholdende PDB og derefter dyrket i en rysteinkubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ved 150 rpm ved 25 ± 2 °C i 3-5 dage i konstant mørke (24 timer) for at stimulere mycelievækst. Efter inkubation blev svampekulturen først filtreret gennem Whatman #1 filterpapir og derefter centrifugeret ved 2500 rpm i 5 minutter for at fjerne resterende mycelium. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved 4 °C til yderligere kvantitativ bestemmelse af oxalat. Til fremstilling af planteprøver blev ca. 0,1 g plantevævsfragmenter ekstraheret tre gange med destilleret vand (2 ml hver gang). Prøverne blev derefter centrifugeret ved 2500 o/min i 5 minutter, supernatanten blev tørfiltreret gennem Whatman nr. 1 filterpapir og opsamlet til videre analyse.
Til kvantitativ analyse af oxalsyre blev reaktionsblandingen fremstillet i et glasproppglas i følgende rækkefølge: 0,2 ml prøve (eller PDB-kulturfiltrat eller oxalsyrestandardopløsning), 0,11 ml bromphenolblåt (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M svovlsyre (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypten) og 0,176 ml 100 mM kaliumdichromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), og derefter blev opløsningen fortyndet til 4,8 ml med destilleret vand, kraftigt blandet og straks anbragt i et 60 °C vandbad. Efter 10 minutter blev reaktionen stoppet ved tilsætning af 0,5 ml natriumhydroxidopløsning (NaOH; 0,75 M). Reaktionsblandingens absorbans (A600) blev målt ved 600 nm ved hjælp af et UV-160 spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB og destilleret vand blev anvendt som kontroller til kvantificering af henholdsvis kulturfiltrater og planteprøver. Oxalsyrekoncentrationerne i kulturfiltraterne, udtrykt som mikrogram oxalsyre pr. milliliter PDB-medium (μg.mL⁻¹), og i bladekstrakterne, udtrykt som mikrogram oxalsyre pr. gram friskvægt (μg.g⁻¹ FW), blev bestemt ved hjælp af en oxalsyrekalibreringskurve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Gennem hele studiet blev alle eksperimenter designet i et fuldstændig randomiseret design (CRD) med seks biologiske replikater pr. behandling og fem potter pr. biologisk replikat (to planter pr. potte), medmindre andet er angivet. Biologiske replikater blev analyseret i duplikat (to tekniske replikater). Tekniske replikater blev brugt til at kontrollere reproducerbarheden af ​​det samme eksperiment, men blev ikke brugt i den statistiske analyse for at undgå falske replikater. Data blev statistisk analyseret ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey-Kramer Honesty Significant Difference (HSD) test (p ≤ 0,05). Til in vitro-eksperimenter blev IC50- og IC99-værdier beregnet ved hjælp af probit-modellen, og 95% konfidensintervaller blev beregnet.
I alt fire isolater blev indsamlet fra forskellige sojabønnemarker i El Ghabiya Governorate, Egypten. På PDA-medium producerede alle isolater cremet hvidt mycelium, der hurtigt blev bomuldshvidt (Figur 1A) og derefter beige eller brunt på sklerotiestadiet. Sklerotier er normalt tætte, sorte, sfæriske eller uregelmæssige i form, 5,2 til 7,7 mm lange og 3,4 til 5,3 mm i diameter (Figur 1B). Selvom fire isolater udviklede et marginalt mønster af sklerotier i kanten af ​​dyrkningsmediet efter 10-12 dages inkubation ved 25 ± 2 °C (Fig. 1A), var antallet af sklerotier pr. plade signifikant forskelligt mellem dem (P < 0,001), hvor isolat 3 havde det højeste antal sklerotier (32,33 ± 1,53 sklerotier pr. plade; Fig. 1C). Tilsvarende producerede isolat #3 mere oxalsyre i PDB end andre isolater (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolat #3 viste typiske morfologiske og mikroskopiske karakteristika for den fytopatogene svamp Sclerotinia sclerotiorum. For eksempel voksede kolonier af isolat #3 hurtigt på PDA, var cremehvide (Figur 1A), omvendt beige eller lys laksegulbrune og krævede 6-7 dage ved 25 ± 2°C for fuldstændigt at dække overfladen af ​​en plade med en diameter på 9 cm. Baseret på ovenstående morfologiske og mikroskopiske karakteristika blev isolat #3 identificeret som Sclerotinia sclerotiorum.
Figur 1. Karakteristika og patogenicitet af S. sclerotiorum-isolater fra almindelige bælgplanter. (A) Mycelievækst af fire S. sclerotiorum-isolater på PDA-medium, (B) sklerotier af fire S. sclerotiorum-isolater, (C) antal sklerotier (pr. plade), (D) oxalsyresekretion på PDB-medium (μg.mL−1) og (E) sygdomssværhedsgrad (%) af fire S. sclerotiorum-isolater på den modtagelige kommercielle bælgplantekultivar Giza 3 under drivhusforhold. Værdier repræsenterer middelværdien ± SD af fem biologiske replikater (n = 5). Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle mellem behandlinger (p < 0,05). (F–H) Typiske symptomer på hvid skimmelsvamp forekom på henholdsvis overjordiske stængler og siliqués 10 dage efter podning med isolat #3 (dpi). (I) Evolutionær analyse af den interne transkriberede spacer (ITS) region af S. sclerotiorum isolat #3 blev udført ved hjælp af maximum likelihood-metoden og sammenlignet med 20 referenceisolater/stammer indhentet fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tallene over klyngelinjerne angiver regiondækningen (%), og tallene under klyngelinjerne angiver forgreningslængden.
For at bekræfte patogeniciteten blev fire opnåede S. sclerotiorum-isolater anvendt til at inokulere den modtagelige kommercielle bønnekultivar Giza 3 under drivhusforhold, hvilket er i overensstemmelse med Kochs postulater (fig. 1E). Selvom alle de opnåede svampeisolater var patogene og kunne inficere den grønne bønne (cv. Giza 3), hvilket forårsagede typiske hvidskimmelsymptomer på alle overjordiske dele (fig. 1F), især på stilkene (fig. 1G) og bælgene (fig. 1H) 10 dage efter inokulering (dpi), var isolat 3 det mest aggressive isolat i to uafhængige eksperimenter. Isolat 3 havde den højeste sygdomssværhedsgrad (%) på bønneplanter (henholdsvis 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 og 76,7 ± 3,1 7, 14 og 21 dage efter infektion; figur 1F).
Identifikationen af ​​det mest invasive S. sclerotiorum-isolat nr. 3 blev yderligere bekræftet baseret på intern transkriberet spacer (ITS)-sekventering (fig. 1I). Fylogenetisk analyse mellem isolat nr. 3 og 20 referenceisolater/stammer viste høj lighed (>99%) mellem dem. Det er værd at bemærke, at S. sclerotiorum-isolatet nr. 3 (533 bp) har en høj lighed med det amerikanske S. sclerotiorum-isolat LPM36 isoleret fra tørrede ærtefrø (GenBank-accessionsnummer MK896659.1; 540 bp) og det kinesiske S. sclerotiorum-isolat YKY211 (GenBank-accessionsnummer OR206374.1; 548 bp), som forårsager violet (Matthiola incana) stængelråd, som alle er grupperet separat øverst i dendrogrammet (figur 1I). Den nye sekvens er blevet deponeret i NCBI-databasen og navngivet "Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25" (GenBank-accessionsnummer PV202792). Det kan ses, at isolat 3 er det mest invasive isolat; derfor blev dette isolat valgt til undersøgelse i alle efterfølgende eksperimenter.
Den antibakterielle aktivitet af diaminen L-ornithin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) ved forskellige koncentrationer (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) mod S. sclerotiorum-isolat 3 blev undersøgt in vitro. Det er bemærkelsesværdigt, at L-ornithin udviste en antibakteriel effekt og gradvist hæmmede den radiale vækst af S. sclerotiorum-hyfer på en dosisafhængig måde (Figur 2A, B). Ved den højeste testede koncentration (125 mg/L) udviste L-ornithin den højeste mycelievæksthæmningsrate (99,62 ± 0,27%; Figur 2B), hvilket var ækvivalent med det kommercielle fungicid Rizolex-T (hæmningsrate 99,45 ± 0,39%; Figur 2C) ved den højeste testede koncentration (10 mg/L), hvilket indikerer en lignende effekt.
Figur 2. In vitro antibakteriel aktivitet af L-ornithin mod Sclerotinia sclerotiorum. (A) Sammenligning af den antibakterielle aktivitet af forskellige koncentrationer af L-ornithin mod S. sclerotiorum med det kommercielle fungicid Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Hæmningsrate (%) af S. sclerotiorum mycelievækst efter behandling med forskellige koncentrationer af L-ornithin (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) eller Rizolex-T (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L). Værdierne repræsenterer middelværdien ± SD af fem biologiske replikater (n = 5). Forskellige bogstaver angiver statistiske forskelle mellem behandlinger (p < 0,05). (D, E) Probit-modelregressionsanalyse af henholdsvis L-ornithin og det kommercielle fungicid Rizolex-T. Probit-modellens regressionslinje er vist som en solid blå linje, og konfidensintervallet (95%) er vist som en stiplet rød linje.
Derudover blev der udført probit-regressionsanalyse, og de tilsvarende plots er vist i tabel 1 og figur 2D, E. Kort fortalt indikerede den acceptable hældningsværdi (y = 2,92x − 4,67) og tilhørende signifikant statistik (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 og p < 0,0001; figur 2D) for L-ornithin en forbedret svampedræbende aktivitet mod S. sclerotiorum sammenlignet med det kommercielle fungicid Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 og p < 0,0001) (tabel 1).
Tabel 1. Værdier for halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) og IC99 (mg/l) af L-ornithin og det kommercielle fungicid “Rizolex-T” mod S. sclerotiorum.
Samlet set reducerede L-ornithin (250 mg/L) signifikant udviklingen og sværhedsgraden af ​​hvid skimmelsvamp på behandlede almindelige bønneplanter sammenlignet med ubehandlede S. sclerotiorum-inficerede planter (kontrol; figur 3A). Kort sagt, selvom sygdommens sværhedsgrad hos ubehandlede inficerede kontrolplanter gradvist steg (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 og 92,33 ± 3,06%), reducerede L-ornithin signifikant sygdommens sværhedsgrad (%) gennem hele eksperimentet (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 og 26,36 ± 3,07) henholdsvis 7, 14 og 21 dage efter behandling (dpt) (figur 3A). Tilsvarende faldt arealet under sygdomsprogressionskurven (AUDPC) fra 1274,33 ± 33,13 i den ubehandlede kontrol til 281,03 ± 7,95, da S. sclerotiorum-inficerede bønneplanter blev behandlet med 250 mg/L L-ornithin, hvilket var lidt lavere end for den positive kontrol 50 mg/L Rizolex-T-fungicid (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Den samme tendens blev observeret i det andet eksperiment.
Fig. 3. Effekt af eksogen påføring af L-ornithin på udviklingen af ​​hvid råd hos almindelige bønner forårsaget af Sclerotinia sclerotiorum under drivhusforhold. (A) Sygdomsprogressionskurve for hvidskimmel hos almindelige bønner efter behandling med 250 mg/L L-ornithin. (B) Arealet under sygdomsprogressionskurven (AUDPC) for hvidskimmel hos almindelige bønner efter behandling med L-ornithin. Værdier repræsenterer middelværdien ± SD af fem biologiske replikater (n = 5). Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle mellem behandlinger (p < 0,05).
Eksogen anvendelse af 250 mg/L L-ornithin øgede gradvist plantens højde (fig. 4A), antallet af grene pr. plante (fig. 4B) og antallet af blade pr. plante (fig. 4C) efter 42 dage. Mens det kommercielle fungicid Rizolex-T (50 mg/L) havde den største effekt på alle undersøgte ernæringsparametre, havde eksogen anvendelse af 250 mg/L L-ornithin den næststørste effekt sammenlignet med ubehandlede kontrolgrupper (fig. 4A-C). På den anden side havde L-ornithinbehandling ingen signifikant effekt på indholdet af fotosyntetiske pigmenter klorofyl a (fig. 4D) og klorofyl b (fig. 4E), men øgede det samlede carotenoidindhold en smule (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) sammenlignet med den negative kontrol (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) og den positive kontrol (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; fig. 4F). Samlet set indikerer disse resultater, at L-ornithin ikke er fytotoksisk for behandlede bælgfrugter og endda kan stimulere deres vækst.
Fig. 4. Effekt af eksogen L-ornithin-påføring på vækstegenskaber og fotosyntetiske pigmenter hos bønneblade inficeret med Sclerotinia sclerotiorum under drivhusforhold. (A) Plantehøjde (cm), (B) Antal grene pr. plante, (C) Antal blade pr. plante, (D) Klorofyl a-indhold (mg g-1 fr wt), (E) Klorofyl b-indhold (mg g-1 fr wt), (F) Totalt carotenoidindhold (mg g-1 fr wt). Værdierne er middelværdi ± SD af fem biologiske replikater (n = 5). Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle mellem behandlingerne (p < 0,05).
In situ histokemisk lokalisering af reaktive iltarter (ROS; udtrykt som hydrogenperoxid [H2O2]) og frie radikaler (udtrykt som superoxidanioner [O2•−]) viste, at eksogen påføring af L-ornithin (250 mg/L) signifikant reducerede akkumuleringen af ​​H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) og O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) sammenlignet med akkumuleringen af ​​både ubehandlede inficerede planter (henholdsvis 173,31 ± 12,06 og 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) og planter behandlet med 50 mg/L af det kommercielle fungicid Rizolex-T (henholdsvis 170,12 ± 9,50 og 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) efter 72 timer. Høje niveauer af H2O2 og O2•− akkumuleredes under hpt (fig. 5A, B). Tilsvarende viste et TCA-baseret malondialdehyd (MDA)-assay, at S. sclerotiorum-inficerede bønneplanter akkumulerede højere niveauer af MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) i deres blade (fig. 5C). Eksogen påføring af L-ornithin reducerede imidlertid signifikant lipidperoxidationen, hvilket fremgår af faldet i MDA-indhold i behandlede planter (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effekt af eksogen L-ornithin-applikation på vigtige markører for oxidativ stress og ikke-enzymatiske antioxidante forsvarsmekanismer i bønneblade inficeret med S. sclerotiorum 72 timer efter infektion under drivhusforhold. (A) Hydrogenperoxid (H2O2; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (B) superoxidanion (O2•−; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (D) samlede opløselige phenoler (mg GAE g−1 FW) ved 72 hpt, (E) samlede opløselige flavonoider (mg RE g−1 FW) ved 72 hpt, (F) samlede frie aminosyrer (mg g−1 FW) ved 72 hpt, og (G) prolinindhold (mg g−1 FW) ved 72 hpt. Værdierne repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen (middelværdi ± SD) for 5 biologiske replikater (n = 5). Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle mellem behandlingerne (p < 0,05).