Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat understøttelse vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
Insulin-nanopartikler (NP'er) med højt indhold af insulin har fundet forskellige anvendelser i forskellige doseringsformer. Dette arbejde har til formål at evaluere effekten af ​​frysetørrings- og spraytørringsprocesser på strukturen af ​​insulinfyldte chitosan-nanopartikler, med eller uden mannitol som kryobeskyttelsesmiddel. Vi vurderede også kvaliteten af ​​disse nanopartikler ved at genopløse dem. Før dehydrering blev partikelstørrelsen af ​​de chitosan/natriumtripolyphosphat/insulin-tværbundne nanopartikler optimeret til at være 318 nm, PDI var 0,18, indkapslingseffektiviteten var 99,4%, og belastningen var 25,01%. Efter rekonstituering bevarede alle nanopartikler, undtagen dem produceret ved en frysetørringsmetode uden brug af mannitol, deres sfæriske partikelstruktur. Sammenlignet med mannitolholdige nanopartikler dehydreret ved enten spray, viste mannitolfri spraytørrede nanopartikler også den mindste gennemsnitlige partikelstørrelse (376 nm) og det højeste indhold af belastning. (25,02%) med lignende indkapslingsrate (98,7%) og PDI (0,20) ved tørrings- eller frysetørringsteknikker. De tørrede nanopartikler ved spraytørring uden mannitol resulterede også i den hurtigste frigivelse af insulin og den højeste effektivitet af cellulær optagelse. Dette arbejde viser, at spraytørring kan dehydrere insulin-nanopartikler uden behov for kryobeskyttelsesmidler sammenlignet med konventionelle frysetørringsmetoder, hvilket skaber større belastningskapacitet, lavere tilsætningsstofkrav og en betydelig fordel med driftsomkostninger.
Siden insulin og dets farmaceutiske præparater blev opdaget i 19221,2,3, har det reddet livet for patienter med type 1-diabetes (T1DM) og type 2-diabetes (T1DM). På grund af dets egenskaber som et protein med høj molekylvægt aggregeres insulin dog let, nedbrydes af proteolytiske enzymer og elimineres via first-pass-effekten. Personer, der diagnosticeres med type 1-diabetes, har brug for insulininjektioner resten af ​​deres liv. Mange patienter, der oprindeligt får diagnosen type 2-diabetes, har også brug for langvarige insulininjektioner. Daglige insulininjektioner er en alvorlig kilde til daglig smerte og ubehag for disse personer med negative virkninger på den mentale sundhed. Som et resultat heraf undersøges andre former for insulinadministration, der forårsager mindre ubehag, såsom oral insulinadministration, grundigt5, da de har potentiale til at genoprette livskvaliteten for cirka 5 milliarder mennesker med diabetes på verdensplan.
Nanopartikelteknologi har givet et betydeligt fremskridt i forsøgene på at tage oral insulin4,6,7. En teknologi, der effektivt indkapsler og beskytter insulin mod nedbrydning med henblik på målrettet levering til specifikke steder på kroppen. Brugen af ​​nanopartikelformuleringer har dog flere begrænsninger, primært på grund af stabilitetsproblemer i partikelsuspensioner. Der kan forekomme en vis aggregering under opbevaring, hvilket reducerer biotilgængeligheden af ​​insulinbelastede nanopartikler8. Derudover skal den kemiske stabilitet af polymermatrixen af ​​nanopartikler og insulin også overvejes for at sikre stabiliteten af ​​insulin-nanopartikler (NP'er). I øjeblikket er frysetørringsteknologi guldstandarden til at skabe stabile NP'er, samtidig med at uønskede ændringer under opbevaring forhindres9.
Frysetørring kræver dog tilsætning af kryobeskyttelsesmidler for at forhindre, at den sfæriske struktur af nanopartikler påvirkes af den mekaniske belastning fra iskrystaller. Dette reducerer mængden af ​​insulin-nanopartikler betydeligt efter frysetørring, da kryobeskyttelsesmidlet optager det meste af vægtforholdet. Derfor viser de producerede insulin-nanopartikler sig ofte at være uegnede til fremstilling af tørpulverformuleringer, såsom orale tabletter og orale film, på grund af behovet for store mængder tørre nanopartikler for at opnå insulinets terapeutiske vindue.
Spraytørring er en velkendt og billig proces i industriel skala til fremstilling af tørre pulvere fra flydende faser i den farmaceutiske industri10,11. Kontrol over partikeldannelsesprocessen muliggør korrekt indkapsling af adskillige bioaktive forbindelser12, 13. Desuden er det blevet en effektiv teknik til fremstilling af indkapslede proteiner til oral administration. Under spraytørring fordamper vandet meget hurtigt, hvilket hjælper med at holde temperaturen i partikelkernen lav11,14, hvilket muliggør dens anvendelse til at indkapsle varmefølsomme komponenter. Før spraytørring skal belægningsmaterialet homogeniseres grundigt med den opløsning, der indeholder de indkapslede ingredienser11,14. I modsætning til frysetørring forbedrer homogenisering før indkapsling ved spraytørring indkapslingseffektiviteten under dehydrering. Da spraytørringsindkapslingsprocessen ikke kræver kryobeskyttelsesmidler, kan spraytørring bruges til at producere tørrede NP'er med højt indhold af stoffer.
Denne undersøgelse rapporterer produktionen af ​​insulinbelastede nanopartikler ved tværbinding af chitosan og natriumtripolyfosfat ved hjælp af en iongelmetode. Iongelering er en fremstillingsmetode, der muliggør produktion af nanopartikler gennem elektrostatiske interaktioner mellem to eller flere ionarter under visse betingelser. Både frysetørrings- og spraytørringsteknikker blev anvendt til at dehydrere de optimerede chitosan/natriumtripolyfosfat/insulin-tværbundne nanopartikler. Efter dehydrering blev deres morfologi analyseret ved SEM. Deres rekombinationsevne blev evalueret ved at måle deres størrelsesfordeling, overfladeladning, PDI, indkapslingseffektivitet og ladningsindhold. Kvaliteten af ​​resolubiliserede nanopartikler produceret ved forskellige dehydreringsmetoder blev også evalueret ved at sammenligne deres insulinbeskyttelse, frigivelsesadfærd og cellulære optagelseseffektivitet.
Den blandede opløsnings pH-værdi og forholdet mellem chitosan og insulin er to nøglefaktorer, der påvirker partikelstørrelsen og indkapslingseffektiviteten (EE) af de endelige nanopartikler, da de direkte påvirker den ionotrope geleringsproces. Den blandede opløsnings pH-værdi viste sig at være stærkt korreleret med partikelstørrelse og indkapslingseffektivitet (fig. 1a). Som vist i fig. 1a faldt den gennemsnitlige partikelstørrelse (nm), og EE steg signifikant, da pH-værdien steg fra 4,0 til 6,0, mens den gennemsnitlige partikelstørrelse begyndte at stige, og EE forblev uændret, da pH-værdien steg til 6,5. Efterhånden som forholdet mellem chitosan og insulin stiger, stiger den gennemsnitlige partikelstørrelse også. Desuden blev der ikke observeret nogen ændring i EE, når nanopartikler blev fremstillet ved et masseforhold mellem chitosan/insulin på over 2,5:1 (w/w) (fig. 1b). Derfor blev de optimale fremstillingsbetingelser i denne undersøgelse (pH 6,0, chitosan/insulin masseforhold på 2,5:1) anvendt. at forberede insulinbelastede nanopartikler til videre undersøgelse. Under disse forberedelsesbetingelser blev den gennemsnitlige partikelstørrelse af insulin-nanopartikler optimeret til at være 318 nm (fig. 1c), PDI var 0,18, indlejringseffektiviteten var 99,4%, zeta-potentialet var 9,8 mV, og insulinbelastningen var 25,01% (m/m). Baseret på resultater fra transmissionselektronmikroskopi (TEM) var de optimerede nanopartikler nogenlunde sfæriske og diskrete med relativt ensartet størrelse (fig. 1d).
Parameteroptimering af insulin-nanopartikler: (a) effekten af ​​pH på den gennemsnitlige diameter og indkapslingseffektivitet (EE) af insulin-nanopartikler (fremstillet ved et masseforhold på 5:1 mellem chitosan og insulin); (b) chitosan og indflydelse af masseforholdet mellem insulin på den gennemsnitlige diameter og indkapslingseffektivitet (EE) af insulin-nanopartikler (fremstillet ved pH 6); (c) partikelstørrelsesfordeling af optimerede insulin-nanopartikler; (d) TEM-mikrografi af optimerede insulin-nanopartikler.
Det er velkendt, at chitosan er en svag polyelektrolyt med en pKa på 6,5. Den er positivt ladet i sure medier, fordi dens primære aminogruppe protoneres af hydrogenioner15. Derfor bruges den ofte som bærer til at indkapsle negativt ladede makromolekyler. I denne undersøgelse blev chitosan brugt til at indkapsle insulin med et isoelektrisk punkt på 5,3. Da chitosan bruges som belægningsmateriale, øges tykkelsen af ​​det ydre lag af nanopartiklerne tilsvarende med stigende andel, hvilket resulterer i en større gennemsnitlig partikelstørrelse. Derudover kan højere niveauer af chitosan indkapsle mere insulin. I vores tilfælde var EE højest, når forholdet mellem chitosan og insulin nåede 2,5:1, og der var ingen signifikant ændring i EE, når forholdet fortsatte med at stige.
Udover forholdet mellem chitosan og insulin spillede pH også en afgørende rolle i fremstillingen af ​​NP'er. Gan et al. 17 undersøgte effekten af ​​pH på partikelstørrelsen af ​​chitosan-nanopartikler. De fandt et kontinuerligt fald i partikelstørrelse, indtil pH nåede 6,0, og en signifikant stigning i partikelstørrelse blev observeret ved pH > 6,0, hvilket stemmer overens med vores observationer. Dette fænomen skyldes, at med stigende pH opnår insulinmolekylet en negativ overfladeladning, hvilket favoriserer elektrostatiske interaktioner med chitosan/natriumtripolyphosphat (TPP)-komplekset, hvilket resulterer i lille partikelstørrelse og høj EE. Men når pH-værdien blev justeret til 6,5, blev aminogrupperne på chitosan deprotoneret, hvilket resulterede i chitosanfoldning. Således resulterer høj pH i mindre eksponering af aminoioner for TPP og insulin, hvilket resulterer i lavere tværbinding, større endelig gennemsnitlig partikelstørrelse og lavere EE.
Analyse af de morfologiske egenskaber ved frysetørrede og spraytørrede nanopartikler kan vejlede valget af bedre dehydrerings- og pulverdannelsesteknikker. Den foretrukne metode bør give lægemiddelstabilitet, ensartet partikelform, høj lægemiddelmængde og god opløselighed i den oprindelige opløsning. I denne undersøgelse blev insulin-nanopartikler med eller uden 1% mannitol anvendt under dehydrering for bedre at kunne sammenligne de to teknikker. Mannitol anvendes som et fyldstof eller kryobeskyttelsesmiddel i forskellige tørpulverformuleringer til frysetørring og spraytørring. For de frysetørrede insulin-nanopartikler uden mannitol, som vist i figur 2a, blev en meget porøs pulverstruktur med store, uregelmæssige og ru overflader observeret under scanningselektronmikroskopi (SEM). Få diskrete partikler blev detekteret i pulveret efter dehydrering (fig. 2e). Disse resultater indikerede, at de fleste nanopartikler blev nedbrudt under frysetørring uden kryobeskyttelsesmiddel. For frysetørrede og spraytørrede insulin-nanopartikler indeholdende 1% mannitol blev der observeret sfæriske nanopartikler med glatte overflader (fig. 2b, d, f, h). Insulin Nanopartikler spraytørret uden mannitol forblev sfæriske, men rynkede på overfladen (fig. 2c). Sfæriske og rynkede overflader diskuteres yderligere i nedenstående test af frigivelsesadfærd og cellulær optagelse. Baseret på det synlige udseende af de tørrede nanopartikler gav både spraytørrede nanopartikler uden mannitol og NP'er frysetørret og spraytørret med mannitol fine NP-pulvere (fig. 2f, g, h). Jo større overfladearealet mellem partikeloverfladerne er, desto højere er opløseligheden og derfor desto højere er frigivelseshastigheden.
Morfologi af forskellige dehydrerede insulin-NP'er: (a) SEM-billede af frysetørrede insulin-NP'er uden mannitol; (b) SEM-billede af frysetørrede insulin-NP'er med mannitol; (c) spraytørrede insulin-NP'er uden mannitol SEM-billede af; (d) SEM-billede af insulin-NP'er spraytørret med mannitol; (e) billede af frysetørrede insulin-NP'er i pulverform uden mannitol; (f) billede af frysetørrede insulin-NP'er med mannitol; (g) billede af spraytørrede insulin-NP'er i pulverform uden mannitol; (h) billede af spraytørrede insulin-NP'er i pulverform med mannitol.
Under frysetørring fungerer mannitol som et kryobeskyttelsesmiddel, der holder NP'er i en amorf form og forhindrer skader fra iskrystaller19. I modsætning hertil er der intet frysetrin under spraytørring. Derfor er mannitol ikke påkrævet i denne metode. Faktisk gav spraytørrede NP'er uden mannitol finere NP'er som tidligere beskrevet. Mannitol kan dog stadig fungere som et fyldstof i spraytørringsprocessen for at give NP'er en mere sfærisk struktur20 (fig. 2d), hvilket hjælper med at opnå ensartet frigivelsesadfærd af sådanne indkapslede NP'er. Derudover er det tydeligt, at nogle store partikler kan detekteres i både frysetørrede og spraytørrede insulin-NP'er, der indeholder mannitol (fig. 2b,d), hvilket kan skyldes akkumulering af mannitol i partikelkernen sammen med det indkapslede insulin. Til. Chitosan-laget. Det er værd at bemærke, at forholdet mellem mannitol og chitosan i denne undersøgelse holdes på 5:1 for at sikre, at den sfæriske struktur forbliver intakt efter dehydrering, således at en stor mængde fyldstof også kan forstørre partikelstørrelsen af ​​de tørrede NP'er.
Fourier-transform infrarød dæmpet totalrefleksionsspektroskopi (FTIR-ATR) karakteriserede den fysiske blanding af frit insulin, chitosan, chitosan, TPP og insulin. Alle dehydrerede NP'er blev karakteriseret ved hjælp af FTIR-ATR-spektroskopi. Det er værd at bemærke, at båndintensiteter på 1641, 1543 og 1412 cm-1 blev observeret i indkapslede NP'er frysetørret med mannitol og i NP'er spraytørret med og uden mannitol (fig. 3). Som tidligere rapporteret var disse styrkeforøgelser forbundet med tværbinding mellem chitosan, TPP og insulin. Undersøgelse af interaktionen mellem chitosan og insulin viste, at i FTIR-spektrene af insulinbelastede chitosan-nanopartikler overlappede chitosanbåndet med insulinbåndet, hvilket øgede carbonylintensitets- (1641 cm-1) og amin- (1543 cm-1) bæltet. Tripolyphosphatgrupperne i TPP er bundet til ammoniumgrupper i chitosan og danner et bånd ved 1412 cm-1.
FTIR-ATR-spektre af frit insulin, chitosan, fysiske blandinger af chitosan/TPP/insulin og NP'er dehydreret ved forskellige metoder.
Desuden er disse resultater i overensstemmelse med dem, der er vist i SEM, som viste, at de indkapslede NP'er forblev intakte både når de blev sprøjtet og frysetørret med mannitol, men i fravær af mannitol producerede kun spraytørring indkapslede partikler. I modsætning hertil var FTIR-ATR-spektrale resultater af NP'er frysetørret uden mannitol meget lig den fysiske blanding af chitosan, TPP og insulin. Dette resultat indikerer, at tværbindingerne mellem chitosan, TPP og insulin ikke længere er til stede i NP'er frysetørret uden mannitol. NP-strukturen blev ødelagt under frysetørring uden kryobeskyttelsesmiddel, hvilket kan ses i SEM-resultaterne (fig. 2a). Baseret på morfologien og FTIR-resultaterne af dehydrerede insulin-NP'er blev kun frysetørrede, spraytørrede og mannitolfri NP'er anvendt til rekonstitueringsforsøg, og kun mannitolfri NP'er på grund af nedbrydningen af ​​mannitolfri NP'er under dehydrering.
Dehydrering anvendes til langtidsopbevaring og genforarbejdning til andre formuleringer. Tørre nanopartiklers evne til at rekonstituere efter opbevaring er afgørende for deres anvendelse i forskellige formuleringer såsom tabletter og film. Vi bemærkede, at den gennemsnitlige partikelstørrelse af de spraytørrede insulin-nanopartikler i fravær af mannitol kun steg en smule efter rekonstituering. På den anden side steg partikelstørrelsen af ​​de spraytørrede og frysetørrede insulin-nanopartikler med mannitol signifikant (Tabel 1). PDI og EE blev ikke signifikant ændret (p > 0,05) efter rekombination af alle nanopartikler i denne undersøgelse (Tabel 1). Dette resultat indikerer, at de fleste partikler forblev intakte efter genopløsning. Tilsætningen af ​​mannitol resulterede dog i en stærkt reduceret insulinbelastning af frysetørrede og spraytørrede mannitol-nanopartikler (Tabel 1). I modsætning hertil forblev insulinbelastningsindholdet af nanopartikler spraytørret uden mannitol det samme som før (Tabel 1).
Det er velkendt, at mængden af ​​nanopartikler er kritisk, når de anvendes til lægemiddelafgivelse. For NP'er med lave mængder kræves der meget store mængder materiale for at nå den terapeutiske tærskel. Den høje viskositet af sådanne høje NP-koncentrationer fører imidlertid til ulemper og vanskeligheder ved henholdsvis oral administration og injicerbare formuleringer 22. Derudover kan insulin-NP'er også bruges til at fremstille tabletter og viskose biofilm 23, 24, hvilket kræver brug af store mængder NP'er ved lave mængder, hvilket resulterer i store tabletter og tykke biofilm, der ikke er egnede til oral anvendelse. Derfor er dehydrerede NP'er med høj insulinmængde yderst ønskelige. Vores resultater tyder på, at den høje insulinmængde af mannitolfri spraytørrede NP'er kan tilbyde mange attraktive fordele for disse alternative afgivelsesmetoder.
Alle dehydrerede NP'er blev opbevaret i køleskabet i tre måneder. SEM-resultater viste, at morfologien af ​​alle dehydrerede NP'er ikke ændrede sig signifikant i løbet af den tre måneder lange opbevaring (fig. 4). Efter rekonstituering i vand viste alle NP'er et lille fald i EE og frigav cirka en lille mængde (~5%) insulin i løbet af den tre måneder lange opbevaringsperiode (tabel 2). Den gennemsnitlige partikelstørrelse af alle nanopartikler steg dog. Partikelstørrelsen af ​​NP'er spraytørret uden mannitol steg til 525 nm, mens partikelstørrelsen af ​​spraytørrede og frysetørrede NP'er med mannitol steg til henholdsvis 872 og 921 nm (tabel 2).
Morfologi af forskellige dehydrerede insulin-nanopartikler opbevaret i tre måneder: (a) SEM-billede af frysetørrede insulin-nanopartikler med mannitol; (b) SEM-billede af spraytørrede insulin-nanopartikler uden mannitol; (c) SEM-billeder af spraytørrede insulin-nanopartikler uden mannitol.
Derudover blev der observeret udfældninger i de rekonstituerede insulin-nanopartikler, der var spraytørret med mannitol og frysetørret (fig. S2). Dette kan skyldes, at store partikler ikke suspenderede korrekt i vandet. Alle ovenstående resultater viser, at spraytørringsteknikken kan beskytte insulin-nanopartikler mod dehydrering, og at store mængder insulin-nanopartikler kan opnås uden fyldstoffer eller kryobeskyttelsesmidler.
Insulinretention blev testet i pH = 2,5 medium med pepsin, trypsin og α-chymotrypsin for at demonstrere NP'ers beskyttende evne mod enzymatisk fordøjelse efter dehydrering. Insulinretentionen af ​​dehydrerede NP'er blev sammenlignet med frisk fremstillede NP'er, og frit insulin blev brugt som negativ kontrol. I dette studie viste frit insulin hurtig insulineliminering inden for 4 timer i alle tre enzymatiske behandlinger (fig. 5a-c). I modsætning hertil viste insulinelimineringstest af NP'er frysetørret med mannitol og NP'er spraytørret med eller uden mannitol signifikant højere beskyttelse af disse NP'er mod enzymatisk fordøjelse, hvilket svarede til beskyttelsen af ​​frisk fremstillede insulin-NP'er (figur 1). 5a-c). Ved hjælp af nanopartikler i pepsin, trypsin og α-chymotrypsin kunne mere end 50%, 60% og 75% af insulinet beskyttes inden for henholdsvis 4 timer (fig. 5a-c). Denne insulinbeskyttende evne kan øge chancen for højere insulinabsorption. i blodbanen25. Disse resultater tyder på, at spraytørring med eller uden mannitol og frysetørring med mannitol kan bevare den insulinbeskyttende evne hos NP'er efter dehydrering.
Beskyttelse og frigivelsesadfærd af dehydrerede insulin-nanopløsninger: (a) beskyttelse af insulin i pepsinopløsning; (b) beskyttelse af insulin i trypsinopløsning; (c) beskyttelse af insulin med α-chymotrypsinopløsning; (d) Frigivelsesadfærden af ​​dehydrerede nanopløsninger i en pH = 2,5 opløsning; (e) frigivelsesadfærden af ​​dehydrerede nanopløsninger i en pH = 6,6 opløsning; (f) frigivelsesadfærden af ​​dehydrerede nanopløsninger i en pH = 7,0 opløsning.
Frisk fremstillede og rekonstituerede tørre insulin-nanopløsninger blev inkuberet i forskellige buffere (pH = 2,5, 6,6, 7,0) ved 37 °C, hvilket simulerede pH-miljøet i mavesækken, tolvfingertarmen og den øvre tyndtarm, for at undersøge insulinens effekt på insulinresistens. Frigivelsesadfærd i forskellige miljøer. Fragment af mave-tarmkanalen. Ved pH = 2,5 viste insulinfyldte NP'er og genopløste tørre insulin-NP'er en initial udbrudsfrigivelse inden for den første time, efterfulgt af en langsom frigivelse over de næste 5 timer (fig. 5d). Denne hurtige frigivelse i begyndelsen er sandsynligvis resultatet af hurtig overfladedesorption af proteinmolekyler, der ikke er fuldt immobiliseret i partiklens indre struktur. Ved pH = 6,5 viste insulinfyldte NP'er og rekonstituerede tørre insulin-NP'er en jævn og langsom frigivelse over 6 timer, da pH-værdien af ​​testopløsningen var den samme som i den NP-fremstillede opløsning (fig. 5e). Ved pH = 7 var NP'erne ustabile og næsten fuldstændigt nedbrudt inden for de første to timer (fig. 5f). Dette skyldes, at deprotonering af chitosan forekommer ved højere pH, hvilket resulterer i et mindre kompakt polymernetværk og frigivelse af fyldt insulin.
Desuden viste de insulin-NP'er, der var spraytørret uden mannitol, en hurtigere frigivelsesprofil end de andre dehydrerede NP'er (fig. 5d-f). Som tidligere beskrevet viste de rekonstituerede insulin-NP'er tørret uden mannitol den mindste partikelstørrelse. Små partikler giver et større overfladeareal, så det meste af det relevante lægemiddel vil være på eller nær partikeloverfladen, hvilket resulterer i hurtig lægemiddelfrigivelse26.
Cytotoksiciteten af ​​NP'er blev undersøgt ved MTT-assay. Som vist i figur S4, viste det sig, at alle dehydrerede NP'er ikke havde nogen signifikant effekt på cellelevedygtighed ved koncentrationer på 50-500 μg/ml, hvilket tyder på, at alle dehydrerede NP'er sikkert kan anvendes til at nå det terapeutiske vindue.
Leveren er det primære organ, hvorigennem insulin udøver sine fysiologiske funktioner. HepG2-celler er en human hepatoma-cellelinje, der almindeligvis anvendes som en in vitro hepatocytoptagelsesmodel. Her blev HepG2-celler brugt til at vurdere cellulær optagelse af dehydrerede NP'er ved hjælp af frysetørrings- og spraytørringsmetoder. Cellulær optagelse ved konfokal laserscanning ved hjælp af flowcytometri og syn efter flere timers inkubation med fri FITC-insulin i en koncentration på 25 μg/ml, frisk fremstillede FITC-insulinfyldte NP'er og dehydrerede FITC-insulinfyldte NP'er ved lige insulinkoncentrationer. Kvantitative mikroskopiobservationer (CLSM) blev udført. Lyofiliserede NP'er uden mannitol blev ødelagt under dehydrering og blev ikke evalueret i denne test. De intracellulære fluorescensintensiteter af frisk fremstillede insulinfyldte NP'er, frysetørrede NP'er med mannitol og spraytørrede NP'er med og uden mannitol (fig. 6a) var 4,3, 2,6, 2,4 og 4,1 gange højere end de frie. FITC-insulin gruppe, henholdsvis (fig. 6b). Disse resultater tyder på, at indkapslet insulin er mere potent i cellulær optagelse end frit insulin, primært på grund af den mindre størrelse af de insulinbelastede nanopartikler, der blev produceret i undersøgelsen.
HepG2-celleoptagelse efter 4 timers inkubation med frisk fremstillede NP'er og dehydrerede NP'er: (a) Fordeling af FITC-insulinoptagelse af HepG2-celler. (b) Geometrisk gennemsnit af fluorescensintensiteter analyseret ved flowcytometri (n = 3), *P < 0,05 sammenlignet med frit insulin.
Ligeledes viste CLSM-billederne, at FITC-fluorescensintensiteterne af frisk fremstillede FITC-insulin-fyldte NP'er og FITC-insulin-fyldte spraytørrede NP'er (uden mannitol) var meget stærkere end de andre prøvers (fig. 6a). Desuden øgede opløsningens højere viskositet med tilsætning af mannitol modstanden mod cellulær optagelse, hvilket resulterede i nedsat insulinproliferation. Disse resultater tyder på, at mannitolfri spraytørrede NP'er udviste den højeste cellulære optagelseseffektivitet, fordi deres partikelstørrelse var mindre end frysetørrede NP'ers efter genopløsning.
Chitosan (gennemsnitlig molekylvægt 100 kDa, 75-85 % deacetyleret) blev købt fra Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Natriumtripolyfosfat (TPP) blev købt fra VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Rekombinant human insulin, der blev anvendt i dette studie, var fra Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-mærket human insulin og 4′,6-diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) blev købt fra Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). HepG2-cellelinjen blev indhentet fra ATCC (Manassas, Virginia, USA). Alle andre reagenser var af analytisk eller kromatografisk kvalitet.
Forbered en 1 mg/ml CS-opløsning ved at opløse den i dobbeltdestilleret vand (DD-vand) indeholdende 0,1% eddikesyre. Forbered 1 mg/ml opløsninger af TPP og insulin ved at opløse dem i henholdsvis DD-vand og 0,1% eddikesyre. Præemulsionen blev fremstillet med en polytron PCU-2-110 højhastighedshomogenisator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Forberedelsesprocessen er som følger: først tilsættes 2 ml TPP-opløsning til 4 ml insulinopløsning, og blandingen omrøres i 30 minutter og blandes fuldstændigt. Derefter blev den blandede opløsning dråbevis tilsat CS-opløsningen gennem en sprøjte under højhastighedsomrøring (10.000 rpm). Blandingerne blev holdt under højhastighedsomrøring (15.000 rpm) i et isbad i 30 minutter, og de blev justeret til en bestemt pH for at opnå tværbundne insulin-NP'er. For yderligere at homogenisere og reducere partikelstørrelsen af ​​insulin-NP'erne blev de sonikeret i en yderligere 30 minutter i et isbad ved hjælp af en sonikator af probetypen (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Tyskland).
Insulin-NPS blev testet for Z-gennemsnitlig diameter, polydispersitetsindeks (PDI) og zetapotentiale ved hjælp af dynamiske lysspredningsmålinger (DLS) med en Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Østrig) ved at fortynde dem i DD-vand ved 25°C. Morfologi og størrelsesfordeling blev karakteriseret ved hjælp af et Hitachi H7600 transmissionselektronmikroskop (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), og billeder blev efterfølgende analyseret ved hjælp af Hitachi-billeddannelsessoftware (Hitachi, Tokyo, Japan). For at vurdere indkapslingseffektiviteten (EE) og belastningskapaciteten (LC) af insulin-NP'er blev NP'erne pipetteret i ultrafiltreringsrør med en molekylvægtgrænse på 100 kDa og centrifugeret ved 500 xg i 30 minutter. Ikke-indkapslet insulin i filtratet blev kvantificeret ved hjælp af et Agilent 1100 Series HPLC-system (Agilent, Santa Clara, Californien, USA) bestående af en kvaternær pumpe, autosampler, kolonnevarmer og DAD. detektor. Insulin blev analyseret med en C18-søjle (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) og detekteret ved 214 nm. Den mobile fase var acetonitril og vand, indeholdende 0,1% TFA, gradientforhold fra 10/90 til 100/0, og kørt i 10 minutter. Den mobile fase blev pumpet med en flowhastighed på 1,0 ml/min. Søjletemperaturen blev indstillet til 20 °C. Beregn procentdelene af EE og LC ved hjælp af ligningerne (1) og ligning (2).
Forskellige CS/insulin-forhold fra 2,0 til 4,0 blev testet for at optimere insulin NP. Forskellige mængder CS-opløsning blev tilsat under fremstillingen, mens insulin/TPP-blandingen blev holdt konstant. Insulin NP'er blev fremstillet i pH-området 4,0 til 6,5 ved omhyggeligt at kontrollere blandingens pH efter tilsætning af alle opløsninger (insulin, TPP og CS). EE og partikelstørrelsen af ​​insulin nanopartikler blev evalueret ved forskellige pH-værdier og CS/insulin-masseforhold for at optimere dannelsen af ​​insulin NP'er.
De optimerede insulin-nanopartikler blev placeret på aluminiumsbeholderen og dækket med væv og strammet med noget tape. Derefter blev de skruede beholdere placeret i en Labconco FreeZone frysetørrer (Labconco, Kansas City, MO, USA) udstyret med en bakketørrer. Temperaturen og vakuumtrykket blev indstillet til -10 °C, 0,350 Torr i de første 2 timer og 0 °C og 0,120 Torr i de resterende 22 timer af de 24 timer for at opnå tørre insulin-nanopartikler.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Schweiz) blev brugt til at generere indkapslet insulin. De valgte tørreparametre var: temperatur 100 °C, fødestrøm 3 L/min og gasstrøm 4 L/min.
Insulin-nanopartikler før og efter dehydrering blev karakteriseret ved hjælp af FTIR-ATR-spektroskopi. Dehydrerede nanopartikler samt frit insulin og chitosan blev analyseret ved hjælp af et Spectrum 100 FTIR-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) udstyret med et universelt ATR-prøvetagningstilbehør (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Signalgennemsnit blev opnået fra 16 scanninger med en opløsning på 4 cm2 i frekvensområdet 4000-600 cm2.
Morfologien af ​​tørre insulin-nanopartikler blev vurderet ved hjælp af SEM-billeder af frysetørrede og spraytørrede insulin-nanopartikler optaget med et Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Den primære parameter, der blev anvendt, var en spænding på 5 keV og en strøm på 30 mA.
Alle dehydrerede insulin-nanopløsninger blev genopløst i dehydreret vand. Partikelstørrelse, PDI, EE og LC blev testet igen ved hjælp af den samme metode som nævnt tidligere for at vurdere deres kvalitet efter dehydrering. Stabiliteten af ​​anhydroinsulin-nanopløsninger blev også målt ved at teste nanopløsningernes egenskaber efter længere tids opbevaring. I denne undersøgelse blev alle nanopløsninger efter dehydrering opbevaret i køleskabet i tre måneder. Efter tre måneders opbevaring blev nanopløsningerne testet for morfologisk partikelstørrelse, PDI, EE og LC.
Opløs 5 ml rekonstituerede NP'er i 45 ml indeholdende simuleret mavevæske (pH 1,2, indeholdende 1% pepsin), tarmvæske (pH 6,8, indeholdende 1% trypsin) eller chymotrypsinopløsning (100 g/ml, i fosfatbuffer, pH 7,8) for at evaluere insulinens effektivitet til at beskytte NP'er efter dehydrering. De blev inkuberet ved 37°C med en omrøringshastighed på 100 rpm. 500 μL af opløsningen blev opsamlet på forskellige tidspunkter, og insulinkoncentrationen blev bestemt ved HPLC.
Frigivelsesadfærden in vitro af frisk fremstillede og dehydrerede insulin-nanopartikler blev testet ved hjælp af dialyseposemetoden (molekylvægtgrænse 100 kDa, Spectra Por Inc.). Frisk fremstillede og rekonstituerede tørre nanopartikler blev dialyseret i væsker ved pH 2,5, pH 6,6 og pH 7,0 (0,1 M fosfatbufret saltvand, PBS) for at simulere pH-miljøet i henholdsvis maven, tolvfingertarmen og den øvre tyndtarm. Alle prøver blev inkuberet ved 37 °C med kontinuerlig omrystning ved 200 rpm. Aspirer væsken uden for 5 ml dialyseposen på følgende tidspunkter: 0,5, 1, 2, 3, 4 og 6 timer, og genopfyld straks volumenet med frisk dialysat. Insulinkontaminering i væsken blev analyseret ved HPLC, og hastigheden af ​​insulinfrigivelse fra nanopartiklerne blev beregnet ud fra forholdet mellem frigivet insulin og total insulin indkapslet i nanopartiklerne (ligning 3).
Humane hepatocellulære carcinomcellelinjer HepG2-celler blev dyrket i skåle med en diameter på 60 mm ved hjælp af Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin29. Kulturerne blev opretholdt ved 37°C, 95% relativ luftfugtighed og 5% CO2. Til optagelsesanalyser blev HepG2-celler podet med 1 × 105 celler/ml på et 8-brønds Nunc Lab-Tek kammerslidesystem (Thermo Fisher, NY, USA). Til cytotoksicitetsanalyser blev de podet i 96-brønds plader (Corning, NY, USA) med en tæthed på 5 × 104 celler/ml.
MTT-assayet blev brugt til at evaluere cytotoksiciteten af ​​frisk fremstillede og dehydrerede insulin-NP'er30. HepG2-celler blev podet i 96-brønds plader med en tæthed på 5 × 104 celler/ml og dyrket i 7 dage før testning. Insulin-NP'er blev fortyndet til forskellige koncentrationer (50 til 500 μg/ml) i dyrkningsmedium og derefter administreret til cellerne. Efter 24 timers inkubation blev cellerne vasket 3 gange med PBS og inkuberet med medium indeholdende 0,5 mg/ml MTT i yderligere 4 timer. Cytotoksicitet blev vurderet ved at måle den enzymatiske reduktion af gul tetrazolium-MTT til lilla formazan ved 570 nm ved hjælp af en Tecan infinite M200 pro spektrofotometerpladelæser (Tecan, Männedorf, Schweiz).
Den cellulære optagelseseffektivitet af NP'er blev testet ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi og flowcytometrianalyse. Hver brønd i Nunc Lab-Tek kammerslidesystemet blev behandlet med frit FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NP'er og rekonstitueret 25 μg/ml dehydrerede FITC-insulin NP'er ved samme koncentration og inkuberet i 4 timer. Cellerne blev vasket 3 gange med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd. Cellerne blev farvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Insulinlokalisering blev observeret ved hjælp af et Olympus FV1000 laserscannings-/to-foton konfokalmikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). Til flowcytometrianalyse blev de samme koncentrationer af 10 μg/ml frit FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NP'er og resolubiliserede dehydrerede FITC-insulin NP'er tilsat til 96-brønds plader podet med HepG2-celler og inkuberet i 4 timer. Efter 4 timers inkubation blev cellerne fjernet og vasket 3 gange med FBS. 5 × 104 celler pr. prøve blev analyseret med et BD LSR II flowcytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA).
Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Sammenligninger mellem alle grupper blev vurderet ved hjælp af envejs-ANOVA eller t-test med IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA), og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Denne undersøgelse demonstrerer fleksibiliteten og evnen ved spraytørring til at dehydrere tværbundne chitosan/TPP/insulin nanopartikler med bedre rekonstituering sammenlignet med standard frysetørringsmetoder, der bruger fyldstoffer eller kryobeskyttelsesmidler med højere belastningskapacitet. De optimerede insulin nanopartikler gav en gennemsnitlig partikelstørrelse på 318 nm og en indkapslingseffektivitet på 99,4%. SEM- og FTIR-resultater efter dehydrering viste, at den sfæriske struktur kun blev opretholdt i spraytørrede NP'er med og uden mannitol og frysetørret med mannitol, men frysetørrede NP'er uden mannitol blev nedbrudt under dehydrering. I rekonstitueringsevnetesten viste insulin nanopartikler spraytørret uden mannitol den mindste gennemsnitlige partikelstørrelse og den højeste belastning ved rekonstituering. Frigivelsesadfærden for alle disse dehydrerede NP'er viste, at de blev hurtigt frigivet i opløsninger med pH = 2,5 og pH = 7, og meget stabile i opløsninger med pH = 6,5. Sammenlignet med andre genopløste dehydrerede NP'er, var NP'erne... Spraytørret uden mannitol viste den hurtigste frigivelse. Dette resultat er i overensstemmelse med det, der observeres i den cellulære optagelsesanalyse, da spraytørrede NP'er i fravær af mannitol næsten fuldstændigt opretholdt den cellulære optagelseseffektivitet af frisk fremstillede NP'er. Disse resultater tyder på, at tørre insulin-nanopartikler fremstillet ved mannitolfri spraytørring er mest egnede til videre forarbejdning til andre vandfri doseringsformer, såsom orale tabletter eller bioadhæsive film.
På grund af problemer med intellektuel ejendomsret er de datasæt, der genereres og/eller analyseres i løbet af den aktuelle undersøgelse, ikke offentligt tilgængelige, men er tilgængelige fra de respektive forfattere efter rimelig anmodning.
Kagan, A. Type 2-diabetes: sociale og videnskabelige årsager, medicinske komplikationer og konsekvenser for patienter og andre. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Udviklingen af ​​insulinindkapsling: er oral administration nu mulig? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nylige fremskridt inden for orale insulinbelastede liposomleveringssystemer til behandling af diabetes. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).