Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at opnå de bedste resultater anbefaler vi, at du bruger en nyere version af din browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden viser vi webstedet uden styling eller JavaScript for at sikre løbende support.
Propionsyre (PPA) bruges til at studere rollen af ​​mitokondriel dysfunktion i neurologiske udviklingsforstyrrelser såsom autismespektrumforstyrrelse. PPA er kendt for at forstyrre mitokondriel biogenese, metabolisme og omsætning. Imidlertid er virkningerne af PPA på mitokondriedynamik, fission og fusion fortsat problematiske på grund af den komplekse tidsmæssige natur af disse mekanismer. Her bruger vi komplementære kvantitative billeddannelsesteknikker til at undersøge, hvordan PPA påvirker mitokondrieultrastruktur, morfologi og dynamik i neuronlignende SH-SY5Y-celler. PPA (5 mM) forårsagede et signifikant fald i mitokondrieareal (p < 0,01), feretdiameter og -omkreds (p < 0,05) og areal 2 (p < 0,01). Mitokondriel event locator-analyse viste en signifikant stigning (p < 0,05) i fissions- og fusionshændelser, hvorved integriteten af ​​det mitokondrielle netværk opretholdes under stressforhold. Derudover blev mRNA-ekspressionen af ​​cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) og OPA1 (p < 0,05) signifikant reduceret. 01). Dette illustrerer ombygningen af ​​mitokondriemorfologi, biogenese og dynamik for at opretholde funktion under stressforhold. Vores data giver ny indsigt i virkningerne af PPA på mitokondriedynamik og fremhæver anvendeligheden af ​​billeddannelsesteknikker til at studere de komplekse reguleringsmekanismer, der er involveret i mitokondrienes stressresponser.
Mitokondrier er integrerede deltagere i en række cellulære funktioner ud over deres typiske roller i energiproduktion og biosyntese. Mitokondriemetabolisme er en nøgleregulator af calciumsignalering, metabolisk og redoxhomeostase, inflammatorisk signalering, epigenetiske modifikationer, celleproliferation, differentiering og programmeret celledød1. Især mitokondriemetabolisme er afgørende for neuronal udvikling, overlevelse og funktion og er bredt impliceret i forskellige manifestationer af neuropatologi2,3,4.
I løbet af det seneste årti er metabolisk status blevet en central regulator for neurogenese, differentiering, modning og plasticitet5,6. For nylig er mitokondriemorfologi og -dynamik blevet særligt vigtige komponenter i mitose, en dynamisk proces, der opretholder en pulje af sunde mitokondrier i cellerne. Mitokondriedynamik reguleres af komplekse, indbyrdes afhængige veje, der spænder fra mitokondriebiogenese og bioenergetik til mitokondriefission, fusion, transport og clearance7,8. Forstyrrelse af nogen af ​​disse integrerende mekanismer forringer vedligeholdelsen af ​​sunde mitokondrienetværk og har vidtrækkende funktionelle konsekvenser for neurologisk udvikling9,10. Faktisk observeres dysregulering af mitokondriedynamik i mange psykiatriske, neurodegenerative og neuroudviklingsmæssige lidelser, herunder autismespektrumforstyrrelser (ASF)11,12.
ASD er en heterogen neurologisk udviklingsforstyrrelse med en kompleks genetisk og epigenetisk arkitektur. Arveligheden af ​​ASD er ubestridt, men den underliggende molekylære ætiologi er fortsat dårligt forstået. Akkumulering af data fra prækliniske modeller, kliniske studier og multi-omics molekylære datasæt giver stigende bevis for mitokondriel dysfunktion ved ASD13,14. Vi har tidligere udført en genomdækkende DNA-methyleringsscreening i en kohorte af patienter med ASD og identificeret differentielt methylerede gener grupperet langs mitokondrielle metaboliske veje15. Vi rapporterede efterfølgende differentiel methylering af centrale regulatorer af mitokondriel biogenese og dynamik, hvilket var forbundet med øget mtDNA-kopiantal og ændret urinmetabolisk profil ved ASD16. Vores data giver stigende bevis for, at mitokondriel dynamik og homeostase spiller en central rolle i patofysiologien af ​​ASD. Derfor er forbedring af den mekanistiske forståelse af forholdet mellem mitokondriel dynamik, morfologi og funktion et centralt mål for den løbende forskning i neurologiske sygdomme karakteriseret ved sekundær mitokondriel dysfunktion.
Molekylære teknikker bruges ofte til at studere specifikke geners rolle i mitokondrielle stressresponser. Denne tilgang kan dog være begrænset af den mangesidede og tidsmæssige karakter af mitotiske kontrolmekanismer. Desuden er differentiel ekspression af mitokondrielle gener en indirekte indikator for funktionelle ændringer, især da kun et begrænset antal gener typisk analyseres. Derfor er der blevet foreslået mere direkte metoder til at studere mitokondriefunktion og bioenergetik17. Mitokondriemorfologi er tæt forbundet med mitokondriedynamik. Mitokondrieform, konnektivitet og struktur er afgørende for energiproduktion og mitokondrie- og celleoverlevelse5,18. Desuden fokuserer de forskellige komponenter i mitose på ændringer i mitokondriemorfologi, som kan tjene som nyttige endepunkter for mitokondriel dysfunktion og danne grundlag for efterfølgende mekanistiske undersøgelser.
Mitokondriemorfologi kan observeres direkte ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), hvilket muliggør detaljeret undersøgelse af cellulær ultrastruktur. TEM visualiserer direkte morfologien, formen og strukturen af ​​mitokondriekristae ved opløsning af individuelle mitokondrier i stedet for udelukkende at stole på gentranskription, proteinekspression eller mitokondriefunktionelle parametre i cellepopulationer17,19,20. Derudover letter TEM studiet af interaktioner mellem mitokondrier og andre organeller, såsom det endoplasmatiske reticulum og autofagosomer, som spiller nøgleroller i mitokondriefunktion og homeostase21,22. Dette gør TEM til et godt udgangspunkt for at studere mitokondriedysfunktion, før man fokuserer på specifikke signalveje eller gener. Efterhånden som mitokondriefunktion bliver mere og mere relevant for neuropatologi, er der et klart behov for at kunne studere mitokondriemorfologi og dynamik direkte og kvantitativt i in vitro neuronale modeller.
I denne artikel undersøger vi mitokondriedynamik i en neuronal model af mitokondriel dysfunktion i autismespektrumforstyrrelser. Vi har tidligere rapporteret differentiel methylering af propionyl-CoA-carboxylase beta (PCCB) i ASD15, en underenhed af det mitokondrielle propionyl-CoA-carboxylase-enzymet PCC. Dysregulering af PCC er kendt for at forårsage toksisk akkumulering af propionylderivater, herunder propionsyre (PPA)23,24,25. PPA har vist sig at forstyrre neuronal metabolisme og ændre adfærd in vivo og er en etableret dyremodel til undersøgelse af neurologiske udviklingsmekanismer involveret i ASD26,27,28. Derudover er det blevet rapporteret, at PPA forstyrrer mitokondriemembranpotentiale, biogenese og respiration in vitro og har været bredt anvendt til at modellere mitokondriel dysfunktion i neuroner29,30. Imidlertid er virkningen af ​​PPA-induceret mitokondriel dysfunktion på mitokondriemorfologi og dynamik fortsat dårligt forstået.
Denne undersøgelse bruger komplementære billeddannelsesteknikker til at kvantificere virkningerne af PPA på mitokondriemorfologi, dynamik og funktion i SH-SY5Y-celler. Først udviklede vi en TEM-metode til at visualisere ændringer i mitokondriemorfologi og ultrastruktur17,31,32. I betragtning af mitokondriernes dynamiske natur33 anvendte vi også mitokondriehændelseslokaliseringsanalyse (MEL) til at kvantificere ændringer i balancen mellem fissions- og fusionshændelser, mitokondrieantal og -volumen under PPA-stress. Endelig undersøgte vi, om mitokondriemorfologi og -dynamik er forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​gener involveret i biogenese, fission og fusion. Samlet set illustrerer vores data udfordringen med at belyse kompleksiteten af ​​de mekanismer, der regulerer mitokondriedynamik. Vi fremhæver anvendeligheden af ​​TEM i studiet af mitokondriemorfologi som et målbart konvergent endepunkt for mitose i SH-SY5Y-celler. Derudover fremhæver vi, at TEM-data giver den rigeste information, når de kombineres med billeddannelsesteknikker, der også indfanger dynamiske begivenheder som reaktion på metabolisk stress. Yderligere karakterisering af de molekylære reguleringsmekanismer, der understøtter neuronal cellemitose, kan give vigtig indsigt i den mitokondrielle komponent i nervesystemet og neurodegenerative sygdomme.
For at inducere mitokondriel stress blev SH-SY5Y-celler behandlet med PPA ved hjælp af 3 mM og 5 mM natriumpropionat (NaP). Før TEM blev prøverne udsat for kryogen prøveforberedelse ved hjælp af højtryksfrysning og frysning (fig. 1a). Vi udviklede en automatiseret mitokondriel billedanalysepipeline til at måle otte morfologiske parametre af mitokondriepopulationer på tværs af tre biologiske replikater. Vi fandt, at PPA-behandling signifikant ændrede fire parametre: areal 2, areal, perimeter og Feret-diameter (fig. 1b-e). Areal 2 faldt signifikant med både 3 mM og 5 mM PPA-behandling (p = 0,0183 og p = 0,002, henholdsvis) (fig. 1b), mens areal (p = 0,003), perimeter (p = 0,0106) og Feret-diameter alle er faldet signifikant. Der var en signifikant reduktion (p = 0,0172) i 5 mM behandlingsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 1c-e). Signifikante reduktioner i areal og omkreds viste, at celler behandlet med 5 mM PPA havde mindre, mere afrundede mitokondrier, og at disse mitokondrier var mindre forlængede end dem i kontrolcellerne. Dette er også i overensstemmelse med et signifikant fald i Feret-diameteren, en uafhængig parameter, der indikerer et fald i den største afstand mellem partikelkanter. Ændringer i cristaes ultrastruktur blev observeret: cristae blev mindre udtalte under påvirkning af PPA-stress (fig. 1a, panel B). Imidlertid afspejlede ikke alle billeder klart cristaes ultrastruktur, så en kvantitativ analyse af disse ændringer blev ikke udført. Disse TEM-data kan afspejle tre mulige scenarier: (1) PPA forstærker fission eller hæmmer fusion, hvilket får eksisterende mitokondrier til at krympe i størrelse; (2) forbedret biogenese skaber nye, mindre mitokondrier eller (3) inducerer begge mekanismer samtidigt. Selvom disse forhold ikke kan skelnes ved TEM, indikerer signifikante morfologiske ændringer ændringer i mitokondriehomeostase og dynamik under PPA-stress. Vi undersøgte efterfølgende yderligere parametre for yderligere at karakterisere disse dynamikker og de potentielle mekanismer, der ligger til grund for dem.
Propionsyre (PPA) omformer mitokondriemorfologi. (a) Repræsentative transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder, der viser, at mitokondriestørrelsen falder, og mitokondrier bliver mindre og mere afrundede med stigende PPA-behandling; henholdsvis 0 mM (ubehandlet), 3 mM og 5 mM. Røde pile indikerer mitokondrier. (b-e) SH-SY5Y-celler behandlet med PPA i 24 timer blev forberedt til TEM, og resultaterne blev analyseret ved hjælp af Fiji/ImageJ. Fire af de otte parametre viste signifikante forskelle mellem kontrolceller (ubehandlede, 0 mM PPA) og behandlede celler (3 mM og 5 mM PPA). (b) Region 2, (c) Areal, (d) Perimeter, (e) Feretdiameter. Envejsanalyse af varians (kontrol vs. behandling) og Dunnetts multiple sammenligningstest blev brugt til at bestemme signifikante forskelle (p < 0,05). Datapunkter repræsenterer den gennemsnitlige mitokondrieværdi for hver enkelt celle, og fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM. De viste data repræsenterer n = 3, mindst 24 celler pr. replikat; i alt 266 billeder blev analyseret; * angiver p < 0,05, ** angiver p < 0,01.
For yderligere at karakterisere, hvordan mitokondriedynamik reagerer på PPA, farvede vi mitokondrier med tetramethylrhodaminethylester (TMRE) og anvendte time-lapse-mikroskopi og MEL-analyse til at lokalisere og kvantificere mitokondrier efter 24 timer ved 3 og 5 mM PPA. Behandling af fissions- og fusionshændelser. (Fig. 2a). Efter MEL-analyse blev mitokondrier yderligere analyseret for at kvantificere antallet af mitokondrielle strukturer og deres gennemsnitlige volumen. Vi observerede en lille, men signifikant stigning i antallet af fissionshændelser, der forekom ved 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] sammenlignet med fissions- [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] og fusions- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] hændelser var signifikant forøget ved 5 mM sammenlignet med kontrol (Fig. 3b). Antallet af mitokondrier steg signifikant ved både 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] og 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (fig. 3c), mens det gennemsnitlige volumen af ​​hver mitokondriestruktur forblev uændret (fig. 3c). 3d). Samlet set tyder dette på, at ombygning af mitokondriedynamikken fungerer som en kompenserende respons, der med succes opretholder integriteten af ​​det mitokondrielle netværk. Stigningen i antallet af fissionshændelser ved 3 mM PPA antyder, at stigningen i antallet af mitokondrier delvist skyldes mitokondriefission, men da det gennemsnitlige mitokondrievolumen forbliver stort set uændret, kan biogenese ikke udelukkes som en yderligere kompenserende respons. Disse data er dog i overensstemmelse med de mindre, runde mitokondriestrukturer observeret af TEM og viser også signifikante ændringer i mitokondriedynamikken induceret af PPA.
Propionsyre (PPA) inducerer dynamisk mitokondriel ombygning for at opretholde netværkets integritet. SH-SY5Y-celler blev dyrket, behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer og farvet med TMRE og Hoechst 33342 efterfulgt af MEL-analyse. (a) Repræsentative time-lapse-mikroskopibilleder, der viser farve og binære maksimale intensitetsprojektioner på tidspunkt 2 (t2) for hver betingelse. Udvalgte regioner angivet i hvert binært billede er forbedret og vist i 3D på tre forskellige tidsrammer (t1-t3) for at illustrere dynamikken over tid; fusionshændelser er fremhævet med grønt; fissionshændelser er fremhævet med grønt. Vist med rødt. (b) Gennemsnitligt antal dynamiske hændelser pr. betingelse. (c) Gennemsnitligt antal mitokondrielle strukturer pr. celle. (d) Gennemsnitligt volumen (µm3) af hver mitokondriel struktur pr. celle. De viste data er repræsentative for n = 15 celler pr. behandlingsgruppe. De viste fejllinjer repræsenterer middelværdi ± SEM, skalalinje = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsyre (PPA) forårsager transkriptionel undertrykkelse af gener forbundet med mitokondriedynamik. SH-SY5Y-celler blev behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer. Relativ genkvantificering blev udført ved hjælp af RT-qPCR og normaliseret til B2M. Mitokondrielle biogenesegener (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 og (d) NFE2L2. Mitokondrielle fusions- og fissionsgener (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 og (i) DRP1. Signifikante forskelle (p < 0,05) blev testet ved hjælp af envejs ANOVA (kontrol vs. behandling) og Dunnett's multiple sammenligningstest: * angiver p < 0,05, ** angiver p < 0,01, og **** angiver p < 0,0001. Søjler repræsenterer gennemsnitlig ekspression ± SEM. De viste data repræsenterer biologiske replikater af n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) og n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Data fra TEM- og MEL-analyser indikerer tilsammen, at PPA ændrer mitokondrienes morfologi og dynamik. Disse billeddannelsesteknikker giver dog ikke indsigt i de underliggende mekanismer, der driver disse processer. Vi undersøgte derfor mRNA-ekspressionen af ​​ni nøgleregulatorer af mitokondriedynamik, biogenese og mitose som reaktion på PPA-behandling. Vi kvantificerede cellemyelomonkogen (cMYC), nuklear respiratorisk faktor (NRF1), mitokondrietranskriptionsfaktor 1 (TFAM), NFE2-lignende transkriptionsfaktor BZIP (NFE2L2), gastrinlignende protein 2 (STOML2), synsnerveatrofi 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) og dynamin-relateret protein 1 (DRP1) efter 24 timers behandling med 3 mM og 5 mM PPA. Vi observerede 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 og p < 0,0001, henholdsvis) og 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-behandling. (Fig. 3a-c). Faldet i mRNA-ekspression var dosisafhængigt: ekspressionen af ​​cMYC, NRF1 og TFAM faldt henholdsvis 5,7, 2,6 og 1,9 gange ved 3 mM og 11,2, 3 og 2,2 gange ved 5 mM. I modsætning hertil blev det centrale redoxbiogenesegen NFE2L2 ikke ændret ved nogen koncentration af PPA, selvom en lignende dosisafhængig tendens til nedsat ekspression blev observeret (Fig. 3d).
Vi undersøgte også ekspressionen af ​​klassiske gener involveret i reguleringen af ​​fission og fusion. STOML2 menes at være involveret i fusion, mitofagi og biogenese, og dets ekspression blev signifikant reduceret (p < 0,0001) med 3 mM (2,4-fold ændring) og 5 mM (2,8-fold ændring) PPA (fig. 1). 3d). Tilsvarende blev OPA1-fusionsgenekspressionen reduceret ved 3 mM (1,6-fold ændring) og 5 mM (1,9-fold ændring) PPA (henholdsvis p = 0,006 og p = 0,0024) (fig. 3f). Vi fandt dog ikke signifikante forskelle i ekspressionen af ​​fusionsgenerne MFN1, MFN2 eller fissionsgenet DRP1 under 24-timers PPA-stress (fig. 3g-i). Derudover fandt vi, at niveauerne af fire fusions- og fissionsproteiner (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) ikke ændrede sig under de samme betingelser (fig. 4a-d). Det er vigtigt at bemærke, at disse data afspejler et enkelt tidspunkt og muligvis ikke afspejler ændringer i proteinekspression eller aktivitetsniveauer i de tidlige stadier af PPA-stress. Signifikante reduktioner i ekspressionen af ​​cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 indikerer dog signifikant transkriptionel dysregulering af mitokondriemetabolisme, biogenese og dynamik. Derudover fremhæver disse data anvendeligheden af ​​billeddannelsesteknikker til direkte at studere ændringer i mitokondriefunktionens sluttilstand.
Fusions- og fissionsfaktorproteinniveauer ændrede sig ikke efter behandling med propionsyre (PPA). SH-SY5Y-celler blev behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer. Proteinniveauer blev kvantificeret ved Western blot-analyse, og ekspressionsniveauer blev normaliseret til total protein. Gennemsnitlig proteinekspression og repræsentative Western blots af mål- og totalprotein er vist. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Søjlerne repræsenterer middelværdi ± SEM, og de viste data er repræsentative for n = 3 biologiske replikater. Multiple sammenligninger (p < 0,05) blev udført ved hjælp af envejs variansanalyse og Dunnett's test. Den originale gel og blot er vist i figur S1.
Mitokondriel dysfunktion er forbundet med multisystemsygdomme, lige fra metaboliske, kardiovaskulære og muskulære sygdomme til neurologiske sygdomme1,10. Mange neurodegenerative og neurodegenerative sygdomme er forbundet med mitokondriel dysfunktion, hvilket understreger vigtigheden af ​​disse organeller gennem hele hjernens levetid. Disse sygdomme omfatter Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom og ASD3,4,18. Adgang til hjernevæv for at studere disse sygdomme er imidlertid vanskelig, især på det mekanistiske niveau, hvilket gør cellulære modelsystemer til et nødvendigt alternativ. I denne undersøgelse bruger vi et cellulært modelsystem, der bruger PPA-behandlede SH-SY5Y-celler, til at rekapitulere den mitokondrielle dysfunktion, der observeres i neuronale sygdomme, især autismespektrumforstyrrelser. Brug af denne PPA-model til at studere mitokondriedynamik i neuroner kan give indsigt i ætiologien af ​​ASD.
Vi undersøgte muligheden for at bruge TEM til at se ændringer i mitokondriemorfologi. Det er vigtigt at bemærke, at TEM skal anvendes korrekt for at maksimere dens effektivitet. Forberedelse af kryoprøver muliggør bedre bevarelse af neuronale strukturer ved samtidig at fiksere cellulære komponenter og reducere dannelsen af ​​artefakter34. I overensstemmelse med dette observerede vi, at neuronlignende SH-SY5Y-celler havde intakte subcellulære organeller og aflange mitokondrier (fig. 1a). Dette fremhæver anvendeligheden af ​​kryogene forberedelsesteknikker til undersøgelse af mitokondriemorfologi i neuronale cellemodeller. Selvom kvantitative målinger er afgørende for objektiv analyse af TEM-data, er der stadig ingen konsensus om, hvilke specifikke parametre der skal måles for at bekræfte mitokondriemorfologiske ændringer. Baseret på et stort antal undersøgelser, der kvantitativt har undersøgt mitokondriemorfologi17,31,32, udviklede vi en automatiseret mitokondriebilledanalysepipeline, der måler otte morfologiske parametre, nemlig: areal, areal2, aspektforhold, perimeter, cirkularitet, grad, Ferret-diameter og rundhed.
Blandt dem reducerede PPA signifikant areal 2, areal, perimeter og Feret-diameter (fig. 1b-e). Dette viste, at mitokondrier blev mindre og mere afrundede, hvilket stemmer overens med tidligere undersøgelser, der viste et fald i mitokondrielt areal efter 72 timers PPA30-induceret mitokondriestress. Disse morfologiske træk kan indikere mitokondriel fission, en nødvendig proces til at sekvestrere beskadigede komponenter fra det mitokondrielle netværk for at fremme deres nedbrydning gennem mitofagi35,36,37. På den anden side kan faldet i gennemsnitlig mitokondriestørrelse være forbundet med øget biogenese, hvilket resulterer i dannelsen af ​​små spirende mitokondrier. Øget fission eller biogenese repræsenterer en kompenserende reaktion for at opretholde mitose mod mitokondriestress. Imidlertid kan nedsat mitokondriel vækst, nedsat fusion eller andre tilstande ikke udelukkes.
Selvom de højopløsningsbilleder, der er skabt af TEM, tillader bestemmelse af morfologiske karakteristika på niveauet af individuelle mitokondrier, producerer denne metode todimensionelle snapshots på et enkelt tidspunkt. For at studere dynamiske reaktioner på metabolisk stress farvede vi mitokondrier med TMRE og anvendte time-lapse-mikroskopi med MEL-analyse, som muliggør 3D-visualisering med høj kapacitet af ændringer i mitokondrie-netværket over tid33,38. Vi observerede subtile, men signifikante ændringer i mitokondriedynamikken under PPA-stress (fig. 2). Ved 3 mM steg antallet af fissionshændelser signifikant, mens fusionshændelser forblev det samme som i kontrollen. En stigning i antallet af både fissions- og fusionshændelser blev observeret ved 5 mM PPA, men disse ændringer var omtrent proportionale, hvilket tyder på, at fissions- og fusionskinetikken når ligevægt ved højere koncentrationer (fig. 2b). Det gennemsnitlige mitokondrievolumen forblev uændret ved både 3 og 5 mM PPA, hvilket indikerer, at mitokondrie-netværkets integritet blev bevaret (fig. 2d). Dette afspejler dynamiske mitokondrie-netværks evne til at reagere på mild metabolisk stress for effektivt at opretholde homeostase uden at forårsage netværksfragmentering. Ved 3 mM PPA er stigningen i fission tilstrækkelig til at fremme overgangen til en ny ligevægt, men mere dybdegående kinetisk ombygning er nødvendig som reaktion på stress induceret af højere koncentrationer af PPA.
Antallet af mitokondrier steg ved begge PPA-stresskoncentrationer, men det gennemsnitlige mitokondrievolumen ændrede sig ikke signifikant (fig. 2c). Dette kan skyldes øget biogenese eller øget deling; i fravær af et signifikant fald i gennemsnitligt mitokondrievolumen er det dog mere sandsynligt, at biosyntesen øges. Dataene i figur 2 understøtter dog eksistensen af ​​to kompenserende mekanismer: en stigning i antallet af fissionshændelser, i overensstemmelse med opregulering af mitokondriefission, og en stigning i antallet af hændelser, i overensstemmelse med mitokondriebiogenese. I sidste ende kan dynamisk kompensation for mild stress bestå af samtidige processer, der involverer fission, fusion, biogenese og mitofagi. Selvom tidligere forfattere har vist, at PPA forstærker mitose30,39 og mitofagi29, leverer vi beviser for ombygning af mitokondriefissions- og fusionsdynamik som reaktion på PPA. Disse data bekræfter de morfologiske ændringer observeret af TEM og giver yderligere indsigt i de mekanismer, der er forbundet med PPA-induceret mitokondriedysfunktion.
Da hverken TEM- eller MEL-analyse gav direkte bevis for de genregulerende mekanismer, der ligger til grund for de observerede morfologiske ændringer, undersøgte vi RNA-ekspressionen af ​​gener involveret i mitokondriel metabolisme, biogenese og dynamik. cMYC-proto-onkogenet er en transkriptionsfaktor involveret i reguleringen af ​​mitokondrier, glykolyse, aminosyre- og fedtsyremetabolisme40. Derudover er cMYC kendt for at regulere ekspressionen af ​​næsten 600 mitokondrielle gener involveret i mitokondriel transkription, translation og kompleks samling, herunder NRF1 og TFAM41. NRF1 og TFAM er to centrale regulatorer af mitose, der virker nedstrøms for PGC-1α for at aktivere mtDNA-replikation. Denne signalvej aktiveres af cAMP- og AMPK-signalering og er følsom over for energiforbrug og metabolisk stress. Vi undersøgte også NFE2L2, en redoxregulator af mitokondriel biogenese, for at bestemme, om virkningerne af PPA kan være medieret af oxidativ stress.
Selvom NFE2L2-ekspressionen forblev uændret, fandt vi et konsistent dosisafhængigt fald i ekspressionen af ​​cMYC, NRF1 og TFAM efter 24 timers behandling med 3 mM og 5 mM PPA (fig. 3a-c). Nedregulering af cMYC-ekspression er tidligere blevet rapporteret som en reaktion på mitokondriel stress42, og omvendt kan nedregulering af cMYC-ekspression forårsage mitokondriel dysfunktion ved at ombygge mitokondriel metabolisme, netværksforbindelse og membranpolarisering43. Interessant nok er cMYC også involveret i reguleringen af ​​mitokondriel fission og fusion42,43 og er kendt for at øge DRP1-fosforylering og mitokondriel lokalisering under celledeling44, samt mediere mitokondriel morfologisk ombygning i neuronale stamceller45. Faktisk udviser cMYC-deficiente fibroblaster reduceret mitokondriestørrelse, hvilket stemmer overens med ændringer induceret af PPA43-stress. Disse data illustrerer et interessant, men endnu uklart forhold mellem cMYC og mitokondriedynamik, hvilket giver et interessant mål for fremtidige studier af PPA-stress-induceret ombygning.
Reduktionen af ​​NRF1 og TFAM er i overensstemmelse med cMYCs rolle som en vigtig transkriptionel aktivator. Disse data er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af humane tyktarmskræftceller, der viser, at PPA reducerede NRF1 mRNA-ekspression efter 22 timer, hvilket var forbundet med ATP-udtømning og øget ROS46. Disse forfattere rapporterede også, at TFAM-ekspression steg efter 8,5 timer, men vendte tilbage til baseline-niveauer efter 22 timer. I modsætning hertil viste Kim et al. (2019), at TFAM mRNA-ekspression var signifikant reduceret efter 4 timers PPA-stress i SH-SY5Y-celler; efter 72 timer var TFAM-proteinekspressionen dog signifikant forøget, og mtDNA-kopitallet var signifikant forøget. Faldet i antallet af mitokondrielle biogenese-gener, som vi observerede efter 24 timer, udelukker således ikke muligheden for, at stigningen i antallet af mitokondrier er forbundet med aktivering af biogenese på tidligere tidspunkter. Tidligere undersøgelser har vist, at PPA signifikant opregulerer PGC-1α mRNA og protein i SH-SY5Y-celler efter 4 timer og 30 minutter, mens propionsyre forstærker mitokondriel biogenese i kalvehepatocytter via PGC-1α efter 12 timer og 39 minutter. Interessant nok er PGC-1α ikke kun en direkte transkriptionel regulator af NRF1 og TFAM, men har også vist sig at regulere aktiviteten af ​​MFN2 og DRP1 ved at regulere fission og fusion47. Samlet set fremhæver dette den tætte kobling af mekanismer, der regulerer mitokondrielle kompensatoriske responser induceret af PPA. Desuden afspejler vores data signifikant dysregulering af transkriptionel regulering af biogenese og metabolisme under PPA-stress.
STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- og DRP1-generne er blandt de centrale regulatorer af mitokondriel fission, fusion og dynamik37,48,49. Der er mange andre gener involveret i mitokondriedynamik, men STOML2, OPA1 og MFN2 har tidligere vist sig at være differentielt methylerede i ASD-kohorter,16 og adskillige uafhængige studier har rapporteret ændringer i disse transkriptionsfaktorer som reaktion på mitokondrie stress50,51.52. Ekspressionen af ​​både OPA1 og STOML2 blev signifikant reduceret ved 3 mM og 5 mM PPA-behandling (fig. 3e, f). OPA1 er en af ​​de klassiske regulatorer af mitokondriefusion gennem direkte interaktion med MFN1 og 2 og spiller en rolle i cristae-remodellering og mitokondriemorfologi53. Den præcise rolle af STOML2 i mitokondriedynamik er fortsat uklar, men beviser tyder på, at det spiller en rolle i mitokondriefusion, biogenese og mitofagi.
STOML2 er involveret i at opretholde mitokondriel respiratorisk kobling og dannelse af respiratoriske kædekomplekser54,55 og har vist sig at ændre kræftcellers metaboliske egenskaber markant56. Studier har vist, at STOML2 fremmer mitokondriemembranpotentiale og biogenese gennem interaktion med BAN og cardiolipin 55, 57, 58. Derudover har uafhængige studier vist, at interaktionen mellem STOML2 og PINK1 regulerer mitofagi59,60. Det er værd at bemærke, at STOML2 har vist sig at interagere direkte med og stabilisere MFN2 og også spiller en vigtig rolle i stabiliseringen af ​​lange OPA1-isoformer ved at hæmme proteasen, der er ansvarlig for OPA1-nedbrydning53,61,62. Reduktionen i STOML2-ekspression observeret i PPA-reaktioner kan gøre disse fusionsproteiner mere modtagelige for nedbrydning gennem ubiquitin- og proteasomafhængige veje48. Selvom den præcise rolle af STOML2 og OPA1 i det dynamiske respons på PPA er uklar, kan nedsat ekspression af disse fusionsgener (Figur 3) forstyrre balancen mellem fission og fusion og føre til reduceret mitokondriestørrelse (Figur 3).1).
På den anden side forblev OPA1-proteinekspressionen uændret efter 24 timer, mens mRNA- og proteinniveauerne af MFN1, MFN2 eller DRP1 ikke ændrede sig signifikant efter PPA-behandling (fig. 3g-i, fig. 4). Dette kan indikere, at der ikke er ændringer i reguleringen af ​​disse faktorer involveret i mitokondriel fusion og fission. Det er dog værd at bemærke, at hvert af disse fire gener også reguleres af posttranskriptionelle modifikationer (PTM'er), der kontrollerer proteinaktivitet. OPA1 har otte alternative splejsningsvarianter, der proteolytisk spaltes i mitokondrier for at producere to forskellige isoformer 63. Balancen mellem lange og korte isoformer bestemmer i sidste ende OPA1's rolle i mitokondriel fusion og vedligeholdelse af mitokondrienetværket 64. DRP1-aktivitet reguleres af calcium/calmodulin-afhængig proteinkinase II (CaMKII) phosphorylering, mens DRP1-nedbrydning reguleres af ubiquitinering og SUMOylering 65. Endelig er både DRP1 og MFN1/2 GTPaser, så aktiviteten kan være påvirket af hastigheden af ​​GTP-produktion i mitokondrier 66. Selvom ekspressionen af ​​disse proteiner forbliver konstant, afspejler dette muligvis ikke uændret proteinaktivitet eller lokalisering 67,68. Faktisk fungerer eksisterende PTM-proteinrepertoirer ofte som den første forsvarslinje, der er ansvarlig for at mediere akutte stressresponser. I nærvær af moderat metabolisk stress i vores model er det sandsynligt, at PTM fremmer øget aktivitet af fusions- og fissionsproteiner for tilstrækkeligt at genoprette mitokondrieintegriteten uden at kræve yderligere aktivering af disse gener på mRNA- eller proteinniveau.
Samlet set fremhæver ovenstående data den komplekse og tidsafhængige regulering af mitokondriemorfologi og udfordringerne ved at belyse disse mekanismer. For at studere genekspression er det først nødvendigt at identificere specifikke målgener i pathway'en. Vores data viser dog, at gener i den samme pathway ikke reagerer på samme måde på den samme stress. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at forskellige gener i den samme pathway kan udvise forskellige tidsmæssige responsprofiler30,46. Derudover er der komplekse posttranskriptionelle mekanismer, der forstyrrer forholdet mellem transkription og genfunktion. Proteomiske undersøgelser kan give indsigt i virkningen af ​​PTM'er og proteinfunktion, men de udgør også udfordringer, herunder metoder med lav gennemløbshastighed, høje signal-støj-forhold og dårlig opløsning.
I denne sammenhæng har studiet af mitokondriemorfologi ved hjælp af TEM og MEL et stort potentiale til at besvare grundlæggende spørgsmål om forholdet mellem mitokondriedynamik og -funktion, og hvordan dette påvirker sygdommen. Vigtigst af alt giver TEM en direkte metode til måling af mitokondriemorfologi som et konvergent endepunkt for mitokondriedysfunktion og dynamik51. MEL giver også en direkte metode til visualisering af fissions- og fusionsbegivenheder i et tredimensionelt cellulært miljø, hvilket muliggør kvantificering af dynamisk mitokondrieombygning, selv i fravær af ændringer i genekspression33. Her fremhæver vi anvendeligheden af ​​mitokondriebilleddannelsesteknikker i sekundære mitokondriesygdomme. Disse sygdomme er typisk karakteriseret ved kronisk mild metabolisk stress, der er karakteriseret ved subtil ombygning af mitokondrienetværk snarere end akut mitokondrieskade. Imidlertid har den mitokondriekompensation, der kræves for at opretholde mitose under kronisk stress, dybtgående funktionelle konsekvenser. I forbindelse med neurovidenskab kan en bedre forståelse af disse kompensationsmekanismer give vigtig information om den pleiotropiske neuropatologi forbundet med mitokondriedysfunktion.
I sidste ende fremhæver vores data anvendeligheden af ​​billeddannelsesteknikker til at forstå de funktionelle konsekvenser af de komplekse interaktioner mellem genekspression, proteinmodifikationer og proteinaktivitet, der kontrollerer neuronal mitokondriedynamik. Vi brugte PPA til at modellere mitokondriel dysfunktion i en neuronal cellemodel for at få indsigt i den mitokondrielle komponent af ASD. SH-SY5Y-celler behandlet med PPA viste ændringer i mitokondriemorfologi: mitokondrier blev små og runde, og cristae var dårligt definerede, når de observeredes ved TEM. MEL-analyse viser, at disse ændringer forekommer samtidig med en stigning i fissions- og fusionshændelser for at opretholde det mitokondrielle netværk som reaktion på mild metabolisk stress. Desuden forstyrrer PPA signifikant den transkriptionelle regulering af mitokondriemetabolisme og homeostase. Vi identificerede cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 som centrale mitokondrieregulatorer, der forstyrres af PPA-stress, og som kan spille en rolle i at mediere PPA-inducerede ændringer i mitokondriemorfologi og -funktion. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for bedre at karakterisere PPA-inducerede tidsmæssige ændringer i genekspression og proteinaktivitet, lokalisering og posttranslationelle modifikationer. Vores data fremhæver kompleksiteten og den indbyrdes afhængighed af de reguleringsmekanismer, der medierer den mitokondrielle stressrespons, og demonstrerer anvendeligheden af ​​TEM og andre billeddannelsesteknikker til mere målrettede mekanistiske studier.
SH-SY5Y-cellelinjen (ECACC, 94030304-1VL) blev købt fra Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium/F-12-næringsblanding (DMEM/F-12) og L-glutamin (SC09411, ScienCell) i 25 cm2-kolber suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) og 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ved 37 °C, 5% CO2. Cellerne blev subdyrket til 80% konfluens ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugeret ved 300 g og udpladet med en densitet på ca. 7 × 105 celler/ml. Alle eksperimenter blev udført på udifferentierede SH-SY5Y-celler mellem passagerne 19-22. PPA administreres som NaP. NaP-pulver (CAS-nr. 137-40-6, kemisk formel C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) opløses i varmt MilliQ-vand til en koncentration på 1 M og opbevares ved 4 °C. På behandlingsdagen fortyndes denne opløsning med 1 M PPA til 3 mM og 5 mM PPA i serumfrit medium (DMEM/F-12 med L-glutamin). Behandlingskoncentrationerne for alle eksperimenter var ingen PPA (0 mM, kontrol), 3 mM og 5 mM PPA. Eksperimenterne blev udført i mindst tre biologiske replikater.
SH-SY5Y-celler blev podet i 25 cm³ kolber med en hastighed på 5,5 × 10µ celler/ml og dyrket i 24 timer. PPA-behandlingen blev tilsat kolben før 24 timers inkubation. Opsaml cellepellets i henhold til normale subkulturprotokoller for pattedyrvæv (beskrevet ovenfor). Resuspender cellepelleten i 100 µl 2,5% glutaraldehyd, 1× PBS og opbevar ved 4 °C indtil forarbejdning. SH-SY5Y-celler blev kortvarigt centrifugeret for at pelletere cellerne og fjerne 2,5% glutaraldehyd, 1× PBS-opløsning. Resuspender sedimentet i en 4% agarosegel fremstillet i destilleret vand (forholdet mellem agarose og sedimentvolumen er 1:1). Agarosestykker blev placeret på gitre på flade plader og overtrukket med 1-hexadecen før højtryksfrysning. Prøverne blev frosset i 100% tør acetone ved -90 °C i 24 timer. Temperaturen blev derefter hævet til -80 °C, og en opløsning af 1 % osmiumtetroxid og 0,1 % glutaraldehyd blev tilsat. Prøverne blev opbevaret ved -80 °C i 24 timer. Derefter blev temperaturen gradvist øget til stuetemperatur over flere dage: fra –80 °C til –50 °C i 24 timer, til –30 °C i 24 timer, til –10 °C i 24 timer og endelig til stuetemperatur.
Efter kryogen forberedelse blev prøverne imprægneret med harpiks, og ultratynde snit (∼100 nm) blev fremstillet ved hjælp af en Leica Reichert UltracutS ultramikrotom (Leica Microsystems). Snittene blev farvet med 2% uranylacetat og blycitrat. Prøverne blev observeret ved hjælp af et FEI Tecnai 20 transmissionselektronmikroskop (ThermoFisher (tidligere FEI), Eindhoven, Holland) der opererede ved 200 kV (Lab6 transmitter) og et Gatan CCD-kamera (Gatan, Storbritannien) udstyret med et Tridiem energifilter.
I hvert teknisk replikat blev der erhvervet mindst 24 enkeltcellebilleder, i alt 266 billeder. Alle billeder blev analyseret ved hjælp af Region of Interest (ROI)-makroen og Mitochondria-makroen. Mitokondrialemakroen er baseret på publicerede metoder17,31,32 og tillader semi-automatiseret batchbehandling af TEM-billeder i Fiji/ImageJ69. Kort sagt: billedet inverteres og spejlvendes ved hjælp af rullende kugle-baggrundssubtraktion (60 pixel radius) og et FFT-båndpasfilter (ved hjælp af henholdsvis 60 og 8 pixel øvre og nedre grænser) og lodret linjeundertrykkelse med en orienteringstolerance på 5%. Det behandlede billede tærskelværdibestemmes automatisk ved hjælp af en maksimal entropi-algoritme, og en binær maske genereres. Billedområder forbundet med manuelt valgte ROI'er i rå TEM-billeder blev ekstraheret, karakteriseret ved mitokondrier og ekskluderet plasmamembranen og andre områder med høj kontrast. For hvert ekstraherede ROI blev binære partikler større end 600 pixels analyseret, og partikelareal, perimeter, større og mindre akser, Feret-diameter, rundhed og cirkularitet blev målt ved hjælp af de indbyggede målefunktioner i Fiji/ImageJ. I overensstemmelse med Merrill, Flippo og Strack (2017) blev areal 2, partikelformatforhold (forhold mellem større og mindre akser) og formfaktor (FF) beregnet ud fra disse data, hvor FF = perimeter 2/4pi x areal. Definitionen af ​​den parametriske formel kan findes i Merrill, Flippo og Strack (2017). De nævnte makroer er tilgængelige på GitHub (se Data Availability Statement). I gennemsnit blev cirka 5.600 partikler analyseret pr. PPA-behandling, i alt cirka 17.000 partikler (data ikke vist).
SH-SH5Y-celler blev placeret i 8-kammer kulturskåle (ThermoFisher, #155411) for at tillade adhæsion natten over og derefter inkuberet med TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) og Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). farvning. Billeder blev erhvervet ved hjælp af 405 nm og 561 nm lasere over et 10 minutters miljø, og råbilleder blev erhvervet som z-stabler indeholdende 10 billedmikrografer med az-trin på 0,2 μm mellem billedrammerne på 12 efterfølgende tidspunkter. Billeder blev indsamlet ved hjælp af en Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superopløsningsplatform (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) med en LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27-linse. Billeder blev analyseret i ImageJ ved hjælp af en tidligere beskrevet pipeline og ImageJ-plugin'et til at måle fusions- og fissionshændelser, gennemsnitligt antal mitokondrielle strukturer og gennemsnitligt mitokondrievolumen pr. celle33. MEL-makroer er tilgængelige på GitHub (se Data Availability Statement).
SH-SY5Y-celler blev dyrket i plader med seks brønde med en tæthed på 0,3 × 106 celler/ml i 24 timer før behandling. RNA blev ekstraheret ved hjælp af Quick-RNA™ Miniprep-protokollen (ZR R1055, Zymo Research) med små ændringer: tilsæt 300 μl RNA-lysebuffer til hver brønd før fjernelse, og lysér hver prøve som et sidste trin med 30 μl DNase/RNase-elueringsfrit vand. Alle prøver blev kontrolleret for mængde og kvalitet ved hjælp af et NanoDrop ND-1000 UV-Vis-spektrofotometer. Total protein fra cellelysater blev opnået ved hjælp af 200 μl RIPA-lysebuffer, og proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved hjælp af Bradford-proteinassayet70.
cDNA-syntese blev udført ved hjælp af Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) i henhold til producentens instruktioner med nogle ændringer. cDNA blev syntetiseret i 20-μl reaktioner ved hjælp af 0,7 til 1 μg total RNA. Primere blev udvalgt fra tidligere publicerede artikler 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1), og ledsagende prober blev designet ved hjælp af PrimerQuest-værktøjet fra Integrated DNA Technologies. Alle gener af interesse blev normaliseret til det nukleare B2M-gen. Genekspressionen af ​​STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC og OPA1 blev målt ved RT-qPCR. Masterblandingen omfattede LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward og reverse primere, cDNA og PCR-kvalitets vand for at give et slutvolumen på 10 μL for hver reaktion. Ekspression af delings- og fissionsgener (DRP1, MFN1/2) blev målt ved hjælp af TaqMan multiplex-assays. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) blev anvendt i henhold til producentens instruktioner med mindre ændringer. Multiplex RT-qPCR-masterblandingen omfatter 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM forward og reverse primere, 10 μM probe, cDNA og PCR-kvalitets vand, hvilket resulterer i et slutvolumen på 20 μL for hver reaktion. RT-qPCR blev udført ved hjælp af Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - serienummer: R0618110). Cyklusbetingelser er vist i tabel S1. Alle cDNA-prøver blev amplificeret i triplikat, og en standardkurve blev genereret ved hjælp af en serie af tifoldige fortyndinger. Outliers i triplikatprøver med cyklustærskelstandardafvigelse (Ct) >0,5 blev fjernet fra analysen for at sikre dataenes reproducerbarhed30,72. Relativ genekspression blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt79-metoden.
Proteinprøver (60 μg) blev blandet med Laemmli-loadingbuffer i forholdet 2:1 og kørt på en 12% farveløs proteingel (Bio-Rad #1610184). Proteinerne blev overført til en PVDF (polyvinylidenfluorid)-membran (#170-84156, Bio-Rad) ved hjælp af Trans-Blot Turbo-systemet (#170-4155, Bio-Rad). Membranen blev blokeret og inkuberet med de passende primære antistoffer (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) (fortyndet 1:1000) i 48 timer, efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer (1:10.000) i 1 time. Membranerne blev derefter afbildet ved hjælp af Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) og optaget ved hjælp af et Bio-Rad ChemiDoc MP-system. ImageLab version 6.1 blev brugt til Western blot-analyse. Den originale gel og blot er vist i figur S1. Information om antistoffer findes i tabel S2.
Datasættene præsenteres som middelværdien og standardfejlen for middelværdien (SEM) af mindst tre uafhængige stikprøver. Datasættene blev testet for normalitet ved hjælp af Shapiro-Wilks-testen (medmindre andet er angivet), før der blev antaget en Gaussisk fordeling og lige store standardafvigelser, og analyserne fortsatte. Derudover blev datasættet analyseret ved hjælp af Fishers MEL LSD (p < 0,05), envejs ANOVA (behandling vs. kontrolmiddelværdi) og Dunnetts multiple sammenligningstest for at bestemme signifikans (p < 0,05). Signifikante p-værdier vises i grafen som *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle statistiske analyser og grafer blev udført og genereret ved hjælp af GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-makroer til TEM-billedanalyse er offentligt tilgængelige på GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makroen Mitochondrial Event Locator (MEL) er offentligt tilgængelig på GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM og Vijaya A. Mitokondrier: Mesterregulatorer af metabolisme, homeostase, stress, aldring og epigenetik. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Multifacetteret mitokondriel dysfunktion i skizofreni, kompleks I som et muligt patologisk mål. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. og Beal, MF Mitokondriel dysfunktion ved Parkinsons sygdom. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG og Mehta V. Stressede mitokondrier: mål for invasion ved Alzheimers sygdom. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF og Ferreira GK. Mitokondrier og hjernen: bioenergetik og mere. Neurotoksiner. Resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropiske mitokondrier: mitokondriernes indvirkning på neuronal udvikling og sygdom. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. og Morais, VA Mitokondriel biogenese i neuroner: hvordan og hvor. internationalitet. J. Mohr. videnskaben. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. og Zhao, J. Regulering af pattedyrs mitokondriedynamik: muligheder og udfordringer. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. og Slack, RS Mitokondriedynamik i reguleringen af ​​neurogenese: fra den udviklende til den voksne hjerne. udvikling. dynamik. 247, 47–53 (2018).