Nuværende *Nuværende adresse: Köln 50931, Tyskland, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegenerationen af ​​mitokondrielle sygdomme betragtes som irreversibel, fordi neuroners metaboliske plasticitet er begrænset, men effekten af ​​mitokondriel dysfunktion på celleautonomien i neuronal metabolisme i kroppen er dårligt forstået. Her introducerer vi det cellespecifikke proteom af Purkinje-neuroner med progressiv OXPHOS-mangel forårsaget af forstyrret mitokondriel fusionsdynamik. Vi fandt, at mitokondriel dysfunktion udløste en dybtgående ændring inden for proteomik, hvilket i sidste ende førte til sekventiel aktivering af præcise metaboliske programmer før celledød. Uventet bestemte vi den åbenlyse induktion af pyruvatcarboxylase (PCx) og andre anti-aging enzymer, der supplerer mellemprodukterne i TCA-cyklussen. Hæmning af PCx forværrede oxidativ stress og neurodegeneration, hvilket indikerer, at åreforkalkning har en beskyttende effekt i neuroner, der mangler OXPHOS. Gendannelsen af ​​mitokondriel fusion i terminalt degenererede neuroner omvender fuldstændigt disse metaboliske egenskaber og forhindrer derved celledød. Vores resultater identificerer tidligere ukendte veje, der giver modstandsdygtighed over for mitokondriel dysfunktion, og viser, at neurodegeneration kan omvendes selv i de sene stadier af sygdommen.
Mitokondriernes centrale rolle i opretholdelsen af ​​neuronal energimetabolisme understreges af de omfattende neurologiske symptomer, der er forbundet med humane mitokondriesygdomme. De fleste af disse sygdomme er forårsaget af genmutationer, der regulerer mitokondrie-genekspression (1, 2) eller gendestruktion relateret til mitokondriedynamik, som indirekte påvirker stabiliteten af ​​mitokondrie-DNA (mtDNA) (3, 4). Arbejde i dyremodeller har vist, at konservative metaboliske veje (5-7) kan aktiveres som reaktion på mitokondriel dysfunktion i det omgivende væv, hvilket giver vigtig information til en dybdegående forståelse af patogenesen af ​​disse komplekse sygdomme. I skarp kontrast hertil er vores forståelse af de metaboliske ændringer i specifikke celletyper forårsaget af den generelle svigt i hjernens mitokondrielle adenosintrifosfat (ATP) produktion fundamental (8), hvilket understreger behovet for at identificere terapeutiske mål, der kan bruges til at forebygge eller forhindre sygdom (9). Manglen på information skyldes, at nerveceller i vid udstrækning anses for at have meget begrænset metabolisk fleksibilitet sammenlignet med celletyperne i det omgivende væv (10). Da disse celler spiller en central rolle i koordineringen af ​​tilførslen af ​​metabolitter til neuroner for at fremme synaptisk transmission og reagere på skader og sygdomstilstande, er evnen til at tilpasse cellemetabolisme til hjernevævets udfordrende forhold næsten begrænset til gliaceller (11-14). Derudover hindrer den iboende cellulære heterogenitet i hjernevæv i høj grad studiet af metaboliske ændringer, der forekommer i specifikke neuronale undergrupper. Som følge heraf vides der kun lidt om de nøjagtige cellulære og metaboliske konsekvenser af mitokondriel dysfunktion i neuroner.
For at forstå de metaboliske konsekvenser af mitokondriel dysfunktion isolerede vi Purkinje-neuroner (PN'er) i forskellige stadier af neurodegeneration forårsaget af ødelæggelse af mitokondrienes ydre membranfusion (Mfn2). Selvom Mfn2-mutationer hos mennesker er forbundet med en form for arvelig motorisk sensorisk neuropati kendt som Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), er den betingede destruktion af Mfn2 hos mus en velkendt metode til induktion af oxidationsfosforylering (OXPHOS) dysfunktion. De forskellige neuronale undertyper (16-19) og den resulterende neurodegenerative fænotype ledsages af progressive neurologiske symptomer, såsom bevægelsesforstyrrelser (18, 19) eller cerebellar ataksi (16). Ved at bruge en kombination af label-free kvantitativ (LFQ) proteomik, metabolomik, billeddannelse og virologiske metoder viser vi, at progressiv neurodegeneration stærkt inducerer pyruvatcarboxylase (PCx) og andre faktorer involveret i arteriosklerose af PN'er in vivo. Ekspressionen af ​​enzymer. For at verificere relevansen af ​​dette fund nedregulerede vi specifikt ekspressionen af ​​PCx i Mfn2-defekte PN'er og fandt, at denne operation forværrede oxidativ stress og accelererede neurodegeneration, hvilket beviste, at azoospermi medfører celledød og metabolisk tilpasningsevne. Alvorlig ekspression af MFN2 kan fuldstændigt redde den terminale degenerative PN med alvorlig OXPHOS-mangel, massivt forbrug af mitokondrielt DNA og et tilsyneladende ødelagt mitokondrielt netværk, hvilket yderligere understreger, at denne form for neurodegeneration endda kan komme sig i et fremskredent stadium af sygdommen før celledød.
For at visualisere mitokondrierne i Mfn2 knockout PN'er anvendte vi en musestamme, der tillader Cre-afhængige mitokondrier at målrette mod Cre-ekspression i gult fluorescerende protein (YFP) (mtYFP) (20), og kontrollerede mitokondriemorfologien in vivo. Vi fandt, at ødelæggelsen af ​​Mfn2-genet i PN'er ville føre til en gradvis deling af mitokondrienetværket (Figur S1A), og den tidligste ændring blev fundet i 3-ugers alderen. I modsætning hertil begyndte den betydelige degeneration af PN-cellelaget, som det fremgår af tabet af Calbindin-immunfarvning, ikke før i 12-ugers alderen (Figur 1, A og B). Tidsforskellen mellem de tidligste ændringer i mitokondriemorfologien og den synlige indtræden af ​​neuronal død fik os til at undersøge de metaboliske ændringer udløst af mitokondriel dysfunktion før celledød. Vi udviklede en fluorescensaktiveret cellesorterings (FACS)-baseret strategi til at isolere YFP (YFP+)-udtrykkende PN (Figur 1C), og i kontrolmus (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), herefter benævnt CTRL (Figur S1B). Optimeringen af ​​gating-strategien baseret på den relative intensitet af YFP-signalet giver os mulighed for at oprense YFP+-legemet (YFPhigh) for PN'er fra ikke-PN'er (YFPneg) (Figur S1B) eller formodede fluorescerende axon/dendritiske fragmenter (YFPlow; Figur S1D, venstre), bekræftet med konfokalmikroskop (Figur S1D, højre). For at verificere identiteten af ​​den klassificerede population udførte vi LFQ-proteomics og derefter principal component-analyse, og fandt, at der er en klar adskillelse mellem YFPhigh- og YFPneg-celler (Figur S1C). YFPhigh-celler viste en nettoberigelse af kendte PN-markører (dvs. Calb1, Pcp2, Grid2 og Itpr3) (21, 22), men ingen berigelse af proteiner, der almindeligvis udtrykkes i neuroner eller andre celletyper (Figur 1D)). En sammenligning mellem prøver i klassificerede YFPhigh-celler indsamlet i uafhængige eksperimenter viste en korrelationskoefficient > 0,9, hvilket demonstrerer god reproducerbarhed mellem biologiske replikater (Figur S1E). Sammenfattende validerede disse data vores plan for akut og specifik isolering af mulig PN. Fordi det anvendte L7-cre-driversystem inducerer mosaikrekombination i den første uge efter fødslen (23), begyndte vi at udskille mus fra CTRL og betinget (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) opsamling af neuroner. Efter at rekombinationen er afsluttet, kaldes den Mfn2cKO ved 4 ugers alderen. Som slutpunkt valgte vi 8 ugers alderen, hvor PN-laget var intakt på trods af den tydelige mitokondrielle fragmentering (Figur 1B og Figur S1A). I ​​alt kvantificerede vi i alt 3013 proteiner, hvoraf omkring 22% var baseret på MitoCarta 2.0-annotationer baseret på mitokondrieproteomet som mitokondrier (Figur 1E) (Figur 1E) (24). Differentialgenekspressionsanalysen udført i uge 8 viste, at kun 10,5% af alle proteiner havde signifikante ændringer (Figur 1F og Figur S1F), hvoraf 195 proteiner var nedreguleret og 120 proteiner var opreguleret (Figur 1F). Det er værd at bemærke, at den "innovative pathway-analyse" af dette datasæt viser, at de differentielt udtrykte gener hovedsageligt tilhører et begrænset sæt af specifikke metaboliske pathways (Figur 1G). Interessant nok, selvom nedreguleringen af ​​signalveje relateret til OXPHOS og calciumsignalering bekræfter induktionen af ​​mitokondriel dysfunktion i fusionsdefekte PN'er, er andre kategorier, der primært involverer aminosyremetabolisme, signifikant opreguleret, hvilket er i overensstemmelse med den metabolisme, der forekommer i mitokondrielle PN'er dysfunktion.
(A) Repræsentative konfokale fotografier af cerebellare sektioner af CTRL- og Mfn2cKO-mus, der viser progressivt tab af PN'er (calbindin, grå); kerner blev modfarvet med DAPI. (B) Kvantificering af (A) (envejsanalyse af varians, ***P <0,001; n = 4 til 6 cirkler fra tre mus). (C) Eksperimentel arbejdsgang. (D) Varmekortfordeling af markører specifikke for Purkinje (øverst) og andre celletyper (midten). (E) Venn-diagram, der viser antallet af mitokondrielle proteiner identificeret i den klassificerede PN. (F) Vulkanplot af differentielt udtrykte proteiner i Mfn2cKO-neuroner efter 8 uger (signifikansgrænseværdi på 1,3). (G) Kreativitetsvejsanalysen viser de fem vigtigste opregulerings- (røde) og nedregulerings- (blå) veje i Mfn2cKO PN klassificeret som 8 uger. Det gennemsnitlige ekspressionsniveau for hvert detekteret protein er vist. Gråtonevarmekort: justeret P-værdi. ns, ikke vigtigt.
Proteomiske data viste, at proteinekspressionen af ​​komplekser I, III og IV gradvist faldt. Komplekser I, III og IV indeholdt alle essentielle mtDNA-kodede underenheder, mens kompleks II, som kun var nuklearkodet, stort set var upåvirket (Figur 2A og Figur S2A). I ​​overensstemmelse med proteomiske resultater viste immunhistokemi af cerebellare vævssektioner, at MTCO1-underenhedsniveauet (mitokondrie cytochrom C-oxidase-underenhed 1) af kompleks IV i PN gradvist faldt (Figur 2B). Den mtDNA-kodede underenhed Mtatp8 blev signifikant reduceret (Figur S2A), mens steady-state-niveauet af den nuklearkodede ATP-syntase-underenhed forblev uændret, hvilket er i overensstemmelse med det kendte stabile ATP-syntase-underenhed F1-kompleks, når mtDNA-ekspressionen er stabil. Dannelsen er konsistent. Afbrydelse (7). Evaluering af mtDNA-niveauet i de sorterede Mfn2cKO PN'er ved hjælp af realtids-polymerasekædereaktion (qPCR) bekræftede det gradvise fald i mtDNA-kopitallet. Sammenlignet med kontrolgruppen var kun omkring 20 % af mtDNA-niveauet bevaret ved 8 ugers alderen (Figur 2C). I overensstemmelse med disse resultater blev konfokalmikroskopifarvning af Mfn2cKO PN'er brugt til at detektere DNA, hvilket viser det tidsafhængige forbrug af mitokondrielle nukleotider (Figur 2D). Vi fandt, at kun nogle kandidater involveret i mitokondriel proteinnedbrydning og stressrespons var opreguleret, herunder Lonp1, Afg3l2 og Clpx, samt OXPHOS-komplekssamlingsfaktorer. Der blev ikke detekteret signifikante ændringer i niveauerne af proteiner involveret i apoptose (Figur S2B). Tilsvarende fandt vi, at mitokondrierne og det endoplasmatiske retikulumkanaler involveret i calciumtransport kun har mindre ændringer (Figur S2C). Derudover fandt evalueringen af ​​autofagi-relaterede proteiner ingen signifikante ændringer, hvilket stemmer overens med den synlige induktion af autofagosomer observeret in vivo ved immunhistokemi og elektronmikroskopi (Figur S3). Den progressive OXPHOS-dysfunktion i PN'er ledsages dog af tydelige ultrastrukturelle mitokondrielle ændringer. Mitokondrielle klynger kan ses i cellekroppene og dendritiske træer hos Mfn2cKO PN'er i alderen 5 og 8 uger, og den indre membranstruktur har gennemgået dybtgående ændringer (Figur S4, A og B). I overensstemmelse med disse ultrastrukturelle ændringer og et signifikant fald i mtDNA viste analyse af akutte cerebrale cerebellare skiver med tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), at mitokondriemembranpotentialet i Mfn2cKO PN'er var signifikant reduceret (Figur S4C).
(A) Tidsforløbsanalyse af ekspressionsniveauet af OXPHOS-komplekset. Betragt kun proteiner med P < 0,05 efter 8 uger (tovejs ANOVA). Stiplet linje: Ingen justering sammenlignet med CTRL. (B) Venstre: Et eksempel på et cerebellart snit mærket med anti-MTCO1-antistof (skalalinje, 20 μm). Området optaget af Purkinje-cellekroppe er dækket af gult. Højre: Kvantificering af MTCO1-niveauer (envejs variansanalyse; n = 7 til 20 celler analyseret fra tre mus). (C) qPCR-analyse af mtDNA-kopinummer i den sorterede PN (envejs variansanalyse; n = 3 til 7 mus). (D) Venstre: Et eksempel på et cerebellart snit mærket med et anti-DNA-antistof (skalalinje, 20 μm). Området optaget af Purkinje-cellekroppe er dækket af gult. Højre: Kvantificering af mtDNA-læsioner (envejs variansanalyse; n = 5 til 9 celler fra tre mus). (E) Et eksempel på et akut cerebellart snit, der viser mitoYFP + Purkinje-celler (pil) i en helcelle-patchclamp-optagelse. (F) Kvantificering af IV-kurve. (G) Repræsentative optagelser af depolariserende strøminjektion i CTRL- og Mfn2cKO Purkinje-celler. Øverste spor: Den første puls, der udløste AP. Nederste spor: Maksimal AP-frekvens. (H) Kvantificering af postsynaptiske spontane input (sPSP'er). Det repræsentative optagelsesspor og dets zoomforhold er vist i (I). Envejs-variansanalyse analyseret n = 5 til 20 celler fra tre mus. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Repræsentative spor af spontan AP optaget ved hjælp af perforeret patchclamp-tilstand. Øverste spor: Maksimal AP-frekvens. Nederste spor: zoom af en enkelt AP. (K) Kvantificer den gennemsnitlige og maksimale AP-frekvens i henhold til (J). Mann-Whitney-test; n = 5 celler blev analyseret fra fire mus. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; ikke vigtigt.
Tydelig OXPHOS-skade blev påvist i den 8 uger gamle Mfn2cKO PN, hvilket indikerer, at neuronernes fysiologiske funktion er alvorligt unormal. Derfor analyserede vi de passive elektriske egenskaber hos OXPHOS-defekte neuroner ved 4 til 5 uger og 7 til 8 uger ved at udføre helcelle-patch-clamp-optagelser i akutte cerebellare skiver (Figur 2E). Uventet var det gennemsnitlige hvilemembranpotentiale og inputmodstanden for Mfn2cKO-neuroner ens med kontrolgruppen, selvom der var subtile forskelle mellem cellerne (Tabel 1). Tilsvarende blev der ved 4 til 5 ugers alderen ikke fundet signifikante ændringer i strøm-spændingsforholdet (IV-kurve) (Figur 2F). Imidlertid overlevede ingen Mfn2cKO-neuroner på 7 til 8 uger gamle IV-regimet (hyperpolariseringstrin), hvilket indikerer, at der er en klar følsomhed over for hyperpolariseringspotentiale på dette sene stadie. I modsætning hertil tolereres de depolariserende strømme, der forårsager gentagne aktionspotentiale (AP)-udladninger, godt i Mfn2cKO-neuroner, hvilket indikerer, at deres samlede udladningsmønstre ikke er signifikant forskellige fra dem hos 8 uger gamle kontrolneuroner (Tabel 1 og Figur 2G). Tilsvarende var frekvensen og amplituden af ​​spontane postsynaptiske strømme (sPSC'er) sammenlignelige med kontrolgruppens, og hyppigheden af ​​begivenheder steg fra 4 uger til 5 uger til 7 uger til 8 uger med en lignende stigning (Figur 2, H og I). Perioden for synaptisk modning i PN'er (25). Lignende resultater blev opnået efter perforerede PN-patches. Denne konfiguration forhindrer mulig kompensation af cellulære ATP-defekter, som det kan ske ved helcelle-patch-clamp-optagelse. Især hvilemembranpotentialet og den spontane affyringsfrekvens for Mfn2cKO-neuroner blev ikke påvirket (Figur 2, J og K). Sammenfattende indikerer disse resultater, at PN'er med tydelig OXPHOS-dysfunktion kan håndtere højfrekvente udladningsmønstre godt, hvilket indikerer, at der er en kompensationsmekanisme, der gør det muligt for dem at opretholde næsten normale elektrofysiologiske reaktioner.
Data er udtrykt som middelværdi ± SEM (envejs variansanalyse, Holm-Sidaks multiple sammenligningstest; *P<0,05). Enhedsnummeret er angivet med parenteser.
Vi satte os for at undersøge, om nogen kategori i proteomikdatasættet (Figur 1G) indeholder signalveje, der kan modvirke alvorlig OXPHOS-mangel, og dermed forklare, hvorfor berørt PN kan opretholde næsten normal elektrofysiologi (Figur 2, E til K). Proteomikanalyse viste, at de enzymer, der er involveret i katabolismen af ​​forgrenede aminosyrer (BCAA), var signifikant opreguleret (Figur 3A og Figur S5A), og at slutproduktet acetyl-CoA (CoA) eller succinyl CoA kan supplere tricarboxylaterne i arteriosklerose-syrecyklussen (TCA). Vi fandt, at indholdet af BCAA-transaminase 1 (BCAT1) og BCAT2 begge steg. De katalyserer det første trin i BCAA-katabolismen ved at generere glutamat fra α-ketoglutarat (26). Alle underenheder, der udgør det forgrenede keto-syredehydrogenase (BCKD)-kompleks, er opreguleret (komplekset katalyserer den efterfølgende og irreversible decarboxylering af det resulterende BCAA-kulstofskelet) (Figur 3A og Figur S5A). Der blev dog ikke fundet nogen åbenlyse ændringer i selve BCAA i den sorterede PN, hvilket kan skyldes den øgede cellulære optagelse af disse essentielle aminosyrer eller brugen af ​​andre kilder (glukose eller mælkesyre) til at supplere TCA-cyklussen (Figur S5B). PN'er, der manglede OXPHOS, viste også øget glutaminnedbrydning og transamineringsaktiviteter ved 8 ugers alderen, hvilket kan afspejles i opreguleringen af ​​mitokondrieenzymerne glutaminase (GLS) og glutaminpyruvat-transaminase 2 (GPT2) (Figur 3, A og C). Det er værd at bemærke, at opreguleringen af ​​GLS er begrænset til den splejsede isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ændringen af ​​Mfn2cKO/CTRL er cirka 4,5 gange, P = 0,05), og dens specifikke opregulering i kræftvæv kan understøtte mitokondriel bioenergi. (27).
(A) Varmekortet viser ændringen i proteinniveau for den specificerede rute efter 8 uger. (B) Eksempel på en cerebellar skive mærket med anti-PCx-antistof (skala bjælke, 20 μm). Den gule pil peger på Purkinje-cellekroppen. (C) Tidsforløbsanalyse af proteinekspression identificeret som en vigtig kandidat til aterosklerose (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 mus). (D) Ovenfor: Et skematisk diagram, der viser de forskellige måder at komme ind i det mærkede kulstof indeholdt i [1-13C]pyruvat-traceren (dvs. via PDH eller transarteriel rute). Nederst: Diagrammet viser procentdelen af ​​enkeltmærket kulstof (M1) omdannet til asparaginsyre, citronsyre og æblesyre efter mærkning af akutte cerebellare skiver med [1-13C]pyruvat (parret t-test; ** P <0,01). (E) Omfattende tidshistorikanalyse af den angivne rute. Overvej kun proteiner med P <0,05 efter 8 uger. Stiplet linje: ingen justeringsværdi (tovejs variansanalyse; * P <0,05; *** P <0,001). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM.
I vores analyse er BCAA-katabolisme blevet en af ​​de vigtigste opreguleringsveje. Denne kendsgerning tyder stærkt på, at ventilationsvolumenet, der går ind i TCA-cyklussen, kan være ændret i PN, der mangler OXPHOS. Dette kan repræsentere en væsentlig form for neuronal metabolisk omlægning, som kan have en direkte indvirkning på neuronal fysiologi og overlevelse under opretholdelse af alvorlig OXPHOS-dysfunktion. I overensstemmelse med denne hypotese fandt vi, at det primære anti-aterosklerotiske enzym PCx er opreguleret (Mfn2cKO/CTRL ændrer sig ca. 1,5 gange; figur 3A), hvilket katalyserer omdannelsen af ​​pyruvat til oxaloacetat (28), som menes at være i hjernevæv. Ekspressionen i er begrænset til astrocytter (29, 30). I overensstemmelse med proteomikresultaterne viste konfokalmikroskopi, at PCx-ekspressionen var specifikt og signifikant forøget i OXPHOS-deficiente PN'er, mens PCx-reaktiviteten primært var begrænset til de tilstødende Bergmann gliaceller i kontrolgruppen (figur 3B). For funktionelt at teste den observerede opregulering af PCx behandlede vi akutte cerebellare skiver med [1-13C]pyruvat-traceren. Da pyruvat blev oxideret af pyruvatdehydrogenase (PDH), forsvandt dets isotopmærkning, men det inkorporeres i TCA-cyklusmellemprodukterne, når pyruvat metaboliseres via vaskulære reaktioner (Figur 3D). Til støtte for vores proteomiske data observerede vi et stort antal markører fra denne tracer i asparaginsyren i Mfn2cKO-skiver, mens citronsyre og æblesyre også havde en moderat tendens, dog ikke signifikant (Figur 3D).
I dopaminneuroner hos MitoPark-mus med mitokondriel dysfunktion forårsaget af dopaminneuroner, der specifikt ødelægger mitokondrietranskriptionsfaktor A-genet (Tfam) (Figur S6B), var PCx-ekspressionen også signifikant opreguleret (31), hvilket indikerer, at acetonesyrearteriosklerose. Forekomsten af ​​sygdommen reguleres under dysfunktionen af ​​neuronal OXPHOS i kroppen. Det er værd at bemærke, at det er blevet fundet, at unikke enzymer (32-34), der kan udtrykkes i neuroner, som kan være forbundet med arteriosklerose, er signifikant opreguleret i PN'er, der mangler OXPHOS, såsom propionyl-CoA-carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA, der omdanner propionyl-CoA til succinyl-CoA, og mitokondrie-æblesyreenzym 3 (ME3), hvis hovedrolle er at genvinde pyruvat fra malat (Figur 3, A og C) (33, 35). Derudover fandt vi en signifikant stigning i Pdk3-enzymet, som phosphorylerer og dermed inaktiverer PDH (36), mens der ikke blev detekteret ændringer i Pdp1-enzymet, der aktiverer PDH, eller selve PDH-enzymkomplekset (Figur 3A). Konsekvent blev fosforyleringen af ​​α1-underenheden α (PDHE1α) af pyruvatdehydrogenase E1-komponenten af ​​PDH-komplekset i Ser293 (kendt for at hæmme enzymaktiviteten af ​​PDH) i Mern2cKO PN'er forstærket (Figur S6C) (Figur S6C). Pyruvat har ingen vaskulær adgang.
Endelig fandt vi, at supersignalvejen for serin- og glycinbiosyntese, den relaterede mitokondrielle folatcyklus (1C) og prolinbiosyntese (Figur 1G og Figur S5C) alle er signifikant opreguleret, ifølge rapporter, under aktiveringsprocessen. Det omgivende væv aktiveres med mitokondriel dysfunktion (5-7). Konfokal analyse, der understøtter disse proteomiske data, viste, at i PN med manglende OXPHOS blev cerebellare skiver af 8 uger gamle mus udsat for serinhydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), et nøgleenzym i den mitokondrielle folatcyklus. Signifikant immunrespons (Figur S5D). I 13 CU-glukose-inkuberede akutte cerebellare skiver bekræftede metaboliske sporingseksperimenter yderligere opreguleringen af ​​serin- og prolinbiosyntese, hvilket indikerer, at strømmen af ​​kulstofisoformer til serin og prolin steg (Figur S5E). Da de reaktioner, der fremmes af GLS og GPT2, er ansvarlige for syntesen af ​​glutamat fra glutamin og transamineringen mellem glutamat og α-ketoglutarat, indikerer deres opregulering, at OXPHOS-deficiente neuroner har en øget efterspørgsel efter glutamat. Dette kan have til formål at opretholde den øgede biosyntese af prolin (figur S5C). I modsætning til disse ændringer viste en proteomisk analyse af cerebellare astrocytter fra PN-specifikke Mfn2cKO-mus, at disse veje (inklusive alle antiperoxidaser) ikke ændrede sig signifikant i ekspression, hvilket demonstrerer, at denne metaboliske omdirigering er selektiv over for nedbrudt PN (fig. S6, D til G).
Sammenfattende afslørede disse analyser signifikant forskellige mønstre af tidsmæssig aktivering af specifikke metaboliske veje i PN'er. Selvom unormal neuronal mitokondriefunktion kan føre til tidlig aterosklerose og 1C-remodellering (Figur 3E og Figur S5C), og endda forudsigelige ændringer i ekspressionen af ​​I- og IV-komplekser, er ændringerne i serin de novo-syntese først tydelige i de sene stadier. OXPHOS-dysfunktion (Figur 3E og Figur S5C). Disse fund definerer en sekventiel proces, hvor den stressinducerede mitokondrie (1C-cyklus) og cytoplasmatiske (serinbiosyntese) reagerer synergistisk med stigningen i aterosklerose i TCA-cyklussen for at omforme neuronal metabolisme.
8 uger gamle OXPHOS-deficiente PN'er kan opretholde højfrekvent excitationsaktivitet og undergå betydelig metabolisk reconnection for at kompensere for mitokondriel dysfunktion. Denne opdagelse rejser en interessant mulighed for, at selv på nuværende tidspunkt kan disse celler også modtage terapeutisk intervention for at forsinke eller forhindre neurodegeneration. Vi løste denne mulighed gennem to uafhængige interventioner. I den første metode designede vi en Cre-afhængig adenoassocieret virus (AAV) vektor, så MFN2 kan udtrykkes selektivt i OXPHOS-deficiente PN'er in vivo (Figur S7A). AAV'en, der koder for MFN2, og det fluorescerende reportergen mCherry (Mfn2-AAV) blev verificeret i primære neuronkulturer in vitro, hvilket forårsagede, at MFN2 blev udtrykt på en Cre-afhængig måde og reddede mitokondriemorfologien, hvorved neuromutation i Mfn2cKO neuroner forhindredes (Figur S7, B, D og E). Dernæst udførte vi in ​​vivo-eksperimenter for stereotaktisk at levere 8 uger gammel Mfn2-AAV til cerebellarbarken hos Mfn2cKO- og kontrolmus og analyserede 12 uger gamle mus (Figur 4A). De behandlede Mfn2cKO-mus døde (Figur 1, A og B) (16). Viral transduktion in vivo resulterede i selektiv ekspression af PN i nogle cerebellare cirkler (Figur S7, G og H). Injektion af kontrol-AAV'en, der kun udtrykker mCherry (Ctrl-AAV), havde ingen signifikant effekt på graden af ​​neurodegeneration hos Mfn2cKO-dyr. I modsætning hertil viste analysen af ​​Mfn2cKO'er transduceret med Mfn2-AAV en signifikant beskyttende effekt af PN-cellelaget (Figur 4, B og C). Især synes neurontætheden at være næsten umulig at skelne fra kontroldyrenes (Figur 4, B og C, og Figur S7, H og I). Ekspressionen af ​​MFN1, men ikke MFN2, er lige så effektiv til at redde neuronal død (Figur 4C og Figur S7, C og F), hvilket indikerer, at ekspressionen af ​​ektopisk MFN1 effektivt kan supplere manglen på MFN2. Yderligere analyse på det enkelte PN-niveau viste, at Mfn2-AAV i vid udstrækning reddede mitokondriernes ultrastruktur, normaliserede mtDNA-niveauer og vendte den høje ekspression af anti-angiogenese-markøren PCx (Figur 4, C til E). Visuel inspektion af de reddede Mfn2cKO-mus i hviletilstand viste, at deres kropsholdning og motoriske symptomer (bevægelse S1 til S3) blev forbedret. Afslutningsvis viser disse eksperimenter, at forsinket genintroduktion af MFN2 i PN'er, der er alvorligt mangelfulde i OXPHOS, er tilstrækkelig til at vende mtDNA-forbrug og inducere åreforkalkning og derved forhindre axondegeneration og neuronal død in vivo.
(A) Et skema, der viser den eksperimentelle tidsplan for injektion af AAV, der koder for MFN2, når den angivne metaboliske vej aktiveres. (B) Repræsentative konfokale billeder af 12 uger gamle cerebellare skiver transduceret efter 8 uger i Mfn2cKO-mus og mærket med anti-Calbindin-antistof. Højre: Skalering af axonfibre. Skalaen af ​​axonzoomet er 450 og 75 μm. (C) Venstre: Kvantificering af Purkinje-celletæthed i AAV-transduktionsløjfen (AAV+) (envejs variansanalyse; n = 3 mus). Højre: mtDNA-fokusanalyse i transduceret PN i uge 12 (uparret t-test; n = 6 celler fra tre mus). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Repræsentative transmissionselektronmikrografer af PN'er af Mfn2cKO cerebellare sektioner transduceret med de angivne virale vektorer. Den lyserøde maske illustrerer det område, der er optaget af dendritter, og den gulprikkede firkant illustrerer zoomen til højre; n repræsenterer kernen. Skalalinje, 1 μm. (E) viser et eksempel på PCx-farvning i PN transduceret efter 12 uger. Skalalinje, 20 μm. OE, overekspression; FC, foldændring.
Endelig undersøgte vi vigtigheden af ​​peroxidase-induceret celleoverlevelse i PN'er, der har oplevet OXPHOS-dysfunktion. Vi genererede mCherry, der koder for AAV-shRNA (short hairpin RNA), som specifikt er målrettet mod muse-PCx mRNA (AAV-shPCx), og injicerede virussen eller dens scrambled control (AAV-scr) i lillehjernen hos Mfn2cKO-mus. Injektionen blev udført i den fjerde uges alder (Figur 5A) for at opnå effektiv PCx-nedbrydning i den periode, hvor PCx-ekspressionen steg (Figur 3C), og PN-cellelaget stadig var intakt (Figur 1A). Det er værd at bemærke, at nedbrydning af PCx (Figur S8A) fører til en betydelig acceleration af PN-død, som er begrænset til den inficerede ring (Figur 5, B og C). For at forstå mekanismen bag de metaboliske effekter induceret af PCx-opregulering, undersøgte vi redoxstatussen af ​​PN'er efter PCx-knockdown, og AAV-medieret optisk biosensor Grx1-roGFP2 blev udtrykt samtidigt (Figur S8, B til D) for at evaluere glutathions relative ændring i peptid-redoxpotentiale (38). Derefter udførte vi to-foton fluorescens-livstidsbilleddannelsesmikroskopi (FLIM) i akutte hjerneskiver af 7 uger gamle Mfn2cKO- eller kontrol-kuldsøskende for at detektere potentielle ændringer i cytoplasmisk redoxstatus efter verifikation af FLIM-betingelser (Figur S8, E til G). Analysen viste en signifikant stigning i oxidationstilstanden af ​​en enkelt Mfn2cKO-PN, der mangler PCx-ekspression, hvilket er forskelligt fra kontrolneuroner eller Mfn2cKO-PN'er, der kun udtrykker scrambled shRNA (Figur 5, D og E). Når PCx-ekspressionen blev nedreguleret, steg procentdelen af ​​Mfn2cKO PN'er, der viste en stærkt oxideret tilstand, med mere end tre gange (figur 5E), hvilket indikerer, at PCx-opregulering opretholdt redoxkapaciteten af ​​degenererede neuroner.
(A) Et skema, der viser den eksperimentelle tidsplan for injektion af AAV, der koder for shPCx, når den angivne metaboliske vej aktiveres. (B) Repræsentative konfokale fotografier af 8 uger gamle cerebellare sektioner i Mfn2cKO-mus transduceret og mærket med anti-calcineurin-antistof efter 4 uger. Skalalinje, 450 μm. (C) Kvantificering af Purkinje-celletæthed i AAV-transducerede loops (envejs variansanalyse; n = 3 til 4 mus). Data udtrykkes som middelværdi ± SEM; ***P < 0,001. (D) Repræsentativt FLIM-billede viser den gennemsnitlige levetid for 7 uger gammel PN, der udtrykker glutathion redox-sensor Grx1-roGFP2, under de specificerede eksperimentelle betingelser. LUT (opslagstabel) forhold: overlevelsestidsinterval (i picosekunder). Skalalinje, 25 μm. (E) Histogrammet viser fordelingen af ​​Grx1-roGFP2 livstidsværdier fra (D) (n=158 til 368 celler i to mus under hver betingelse). Cirkeldiagrammet over hvert histogram viser antallet af celler med signifikant længere (rød, oxideret) eller kortere (blå, reduceret) levetidsværdier, som overstiger 1 SD af den gennemsnitlige levetidsværdi i CTRL-AAV-scr. (F) Den foreslåede model viser den beskyttende effekt af opregulering af neuronal PCx.
Alt i alt viser de data, vi leverer her, at reekspression af MFN2 fuldstændigt kan redde fremskreden PN med alvorlig OXPHOS-mangel, alvorlig mtDNA-udtømning og ekstremt unormal ista-lignende morfologi, og derved give kontinuerlig fremgang selv ved fremskredne sygdomme. Neurodegeneration giver reversibel bevis for stadiet før celledød. Denne grad af metabolisk fleksibilitet understreges yderligere af neuroners evne til at inducere aterosklerose (en omlægning af TCA-cyklussen), hvilket hæmmer PCx-ekspression i PN'er, der mangler OXPHOS, og forstærker celledød, hvorved det spiller en beskyttende rolle (Figur 5F).
I denne undersøgelse fremlagde vi bevis for, at PN'ers reaktion på OXPHOS-dysfunktion er gradvist at konvergere til TCA-cyklus aterosklerose gennem den differentielle aktiveringsvej aktiveret af metaboliske programmer. Vi bekræftede den proteomiske analyse med mange komplementære metoder og afslørede, at neuroner, når de udfordres af alvorlig mitokondriel dysfunktion, har en tidligere ukendt form for metabolisk elasticitet. Til vores overraskelse markerer hele omledningsprocessen ikke nødvendigvis den terminale metaboliske tilstand, der ledsager neurodegeneration gradvist og irreversibelt, men vores data tyder på, at det kan udgøre en vedligeholdelsesneuron, selv i stadiet før celledød - en funktionel kompensationsmekanisme. Dette fund indikerer, at neuroner har en betydelig grad af metabolisk plasticitet i kroppen. Denne kendsgerning beviser, at den senere genindførelse af MFN2 kan vende ekspressionen af ​​​​vigtige metaboliske markører og forhindre PN-degeneration. Tværtimod hæmmer det aterosklerose og accelererer transseksuelle nerver.
Et af de mest fascinerende fund i vores forskning er, at PN'er, der mangler OXPHOS, kan modificere TCA-cyklusmetabolismen ved at opregulere enzymer, der specifikt stimulerer åreforkalkning. Metabolisk omlejring er et almindeligt træk ved kræftceller, hvoraf nogle er afhængige af glutamin for at supplere TCA-cyklusmellemprodukter for at producere reducerende ækvivalenter, som driver respirationskæden og opretholder produktionen af ​​lipid- og nukleotidbiosynteseforløbere (39, 40). En nylig undersøgelse viste, at i perifere væv, der oplever OXPHOS-dysfunktion, er genopkoblingen af ​​glutamin/glutamatmetabolisme også et fremtrædende træk (5, 41), hvor retningen af ​​glutamins indtræden i TCA-cyklussen afhænger af på grund af sværhedsgraden af ​​OXPHOS-skade (41). Der mangler dog klare beviser for enhver lighed mellem neuronal metabolisk plasticitet i kroppen og dens mulige relevans i sygdomskonteksten. I en nylig in vitro-undersøgelse blev det vist, at primære kortikale neuroner mobiliserer glutamatpuljer til neurotransmission og derved fremmer oxidativ metabolisme og åreforkalkning under metaboliske stressforhold (42). Det er værd at bemærke, at pyruvatcarboxylering under den farmakologiske hæmning af TCA-cyklusenzymet succinatdehydrogenase menes at opretholde syntesen af ​​oxaloacetat i dyrkede cerebellare granulneuroner (34). Den fysiologiske relevans af disse mekanismer for hjernevæv (hvor åreforkalkning menes hovedsageligt at være begrænset til astrocytter) har dog stadig vigtig fysiologisk betydning (43). I dette tilfælde viser vores data, at PN'er beskadiget af OXPHOS i kroppen kan omstilles til BCAA-nedbrydning og pyruvatcarboxylering, som er de to hovedkilder til tilskud af TCA-pool-mellemprodukter. Selvom det formodede bidrag fra BCAA-katabolisme til neuronal energimetabolisme er blevet foreslået, er der, udover glutamats og GABAs rolle for neurotransmission (44), stadig intet bevis for disse mekanismer in vivo. Derfor er det let at spekulere i, at dysfunktionelle PN'er automatisk kan kompensere for forbruget af TCA-mellemprodukter drevet af assimilationsprocessen ved at øge åreforkalkning. Især kan opregulering af PCx være nødvendig for at opretholde en øget efterspørgsel efter asparaginsyre, hvilket antydes i prolifererende celler med mitokondriel dysfunktion (45). Vores metabolomiske analyse afslørede dog ingen signifikante ændringer i steady-state-niveauet af asparaginsyre i Mfn2cKO PN'er (Figur S6A), hvilket formodentlig afspejler den forskellige metaboliske udnyttelse af asparaginsyre mellem prolifererende celler og post-mitotiske neuroner. Selvom den nøjagtige mekanisme for PCx-opregulering i dysfunktionelle neuroner in vivo stadig mangler at blive karakteriseret, demonstrerede vi, at denne for tidlige respons spiller en vigtig rolle i at opretholde neuronernes redoxtilstand, hvilket blev demonstreret i FLIM-eksperimenter på cerebellare skiver. Især kan forhindring af PN'er i at opregulere PCx føre til en mere oxideret tilstand og accelerere celledød. Aktivering af BCAA-nedbrydning og carboxylering af pyruvat er ikke måder at karakterisere de perifere væv med mitokondriel dysfunktion (7). Derfor synes de at være et prioriteret træk ved OXPHOS-deficiente neuroner, selvom de ikke er det eneste træk, der er vigtigt for neurodegeneration.
Cerebellar sygdom er en heterogen type neurodegenerativ sygdom, der normalt manifesterer sig som ataksi og ofte beskadiger PN'er (46). Denne neuronpopulation er særligt sårbar over for mitokondriel dysfunktion, fordi deres selektive degeneration hos mus er tilstrækkelig til at reproducere mange af de motoriske symptomer, der karakteriserer human spinocerebellar ataksi (16, 47, 48). Ifølge rapporter er en transgen musemodel med et mutantgen forbundet med human spinocerebellar ataksi og har mitokondriel dysfunktion (49, 50), hvilket understreger vigtigheden af ​​at studere konsekvenserne af OXPHOS-mangel i PNPH. Derfor er det særligt velegnet til effektivt at isolere og studere denne unikke neuronpopulation. Da PN'er er meget følsomme over for tryk og tegner sig for en lav andel af hele cerebellarcellepopulationen, er selektiv separation af dem som hele celler stadig et udfordrende aspekt for mange omics-baserede studier. Selvom det er næsten umuligt at opnå absolut ingen kontaminering af andre celletyper (især voksent væv), kombinerede vi et effektivt dissociationstrin med FACS for at opnå et tilstrækkeligt antal levedygtige neuroner til downstream proteomisk analyse og have en ret høj proteindækning (ca. 3000 proteiner) sammenlignet med det eksisterende datasæt for hele lillehjernen (51). Ved at bevare levedygtigheden af ​​hele celler giver den metode, vi præsenterer her, os ikke kun mulighed for at kontrollere ændringerne i de metaboliske veje i mitokondrierne, men også for at kontrollere ændringerne i deres cytoplasmatiske modparter, hvilket supplerer brugen af ​​mitokondrielle membranmærker til at berige celletypen. Den nye metode til antallet af mitokondrier i komplekse væv (52, 53). Den metode, vi beskriver, er ikke kun relateret til studiet af Purkinje-celler, men kan let anvendes på enhver celletype for at adressere metaboliske ændringer i syge hjerner, herunder andre modeller af mitokondriel dysfunktion.
Endelig har vi identificeret et terapeutisk vindue under denne metaboliske omlejringsproces, der fuldstændigt kan vende de vigtigste tegn på cellulær stress og forhindre neuronal degeneration. Derfor kan forståelsen af ​​de funktionelle implikationer af den her beskrevne omledningsføring give grundlæggende indsigt i mulige behandlinger til opretholdelse af neuronal levedygtighed under mitokondriel dysfunktion. Fremtidig forskning med det formål at dissekere ændringer i energimetabolisme i andre hjernecelletyper er nødvendig for fuldt ud at afdække anvendeligheden af ​​dette princip på andre neurologiske sygdomme.
MitoPark-mus er tidligere blevet beskrevet (31). C57BL/6N-mus med loxP-flankerende Mfn2-gener er tidligere blevet beskrevet (18) og krydset med L7-Cre-mus (23). Det resulterende dobbelt heterozygote afkom blev derefter krydset med homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP-mus for at generere Purkinje-specifikke gen-knockouts for Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I en delmængde af parring blev Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allelen (stop-mtYFP) introduceret gennem yderligere krydsninger (20). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske, nationale og institutionelle retningslinjer og godkendt af LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Dyrearbejdet følger også retningslinjerne fra European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Efter bedøvelse af den gravide kvindes cervikale dislokation isoleres museembryoet (E13). Cortex blev dissekeret i Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) tilsat 10 mM Hepes og overført til Dulbeccos Modified Eagle's Medium indeholdende papain (20 U/ml) og cystein (1μg/ml). Inkuber vævet i DMEM) og dissocier det ved enzymatisk fordøjelse. (Ml) ved 37°C i 20 minutter og derefter mekanisk formalet i DMEM tilsat 10% føtalt bovint serum. Cellerne blev podet på dækglas belagt med polylysin med en densitet på 2×106 pr. 6 cm dyrkningsskål eller med en densitet på 0,5×105 celler/cm2 til billedanalyse. Efter 4 timer blev mediet erstattet med Neurobasal serumfrit medium indeholdende 1% B27-tilskud og 0,5 mM GlutaMax. Neuronerne blev derefter holdt ved 37°C og 5% CO2 under hele eksperimentet og fodret en gang om ugen. For at inducere rekombination in vitro blev 3 μl (24-brønds kulturskål) eller 0,5 μl (24-brønds plade) af følgende AAV9-virusvektor anvendt til at behandle neuroner på den anden dag in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalognummer 105530-AAV9) og AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalognummer 105545-AAV9).
Mus Mfn1 og Mfn2 komplementært DNA (opnået fra henholdsvis Addgene plasmid #23212 og #23213) er markeret med V5-sekvensen (GKPIPNPLLGLDST) ved C-terminalen og er fusioneret med mCherry i frame gennem T2A-sekvensen. Grx1-roGFP2 er en gave fra Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Ved at erstatte tdTomato-kassetten ved hjælp af konventionelle kloningsmetoder blev kassetten subklonet ind i pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-rygraden (Addgene referencenummer 28306) for at generere pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 og pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorer. En lignende strategi blev anvendt til at generere kontrolvektoren pAAV-CAG-FLEX-mCherry. For at generere AAV-shPCx-konstruktionen kræves en plasmid-AAV-vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), som indeholder DNA-sekvensen, der koder for det shRNA, der er målrettet mod muse-PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Under kontrol af U6-promotoren anvendes mCherry under kontrol af CMV-promotoren. Produktionen af ​​​​hjælpende AAV-vektorer blev udført i henhold til producentens instruktioner (Cell Biolabs). Kort sagt, brug et transferplasmid, der transient bærer mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry). Transfektion af 293AAV-celler-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) eller Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodende gen, samt kodende for AAV1-kapsidprotein og tilbehørsprotein. Pakningsplasmidplasmid ved hjælp af calciumphosphatmetoden. Den rå virussupernatant blev opnået ved fryse-optøningscyklusser i et tøris/ethanolbad og lyseret celler i fosfatbufret saltvand (PBS). AAV-vektoren blev oprenset ved diskontinuerlig iodixanolgradient-ultracentrifugering (24 timer ved 32.000 rpm og 4°C) og koncentreret ved hjælp af et Amicon ultra-15 centrifugalfilter. Genomtiter af AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genomkopi (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX blev som tidligere beskrevet (54), målt ved realtids kvantitativ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) og AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primære neuroner blev skrabet af i iskold 1x PBS, pelleteret og derefter homogeniseret i 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriumdeoxycholat/PBS lysisbuffer indeholdende fosfatase og proteasehæmmer (Roche). Proteinkvantificering blev udført ved hjælp af bicinchoninsyreassayet (Thermo Fisher Scientific). Proteinerne blev derefter separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og derefter blottet på en polyvinylidenfluoridmembran (GE Healthcare). Bloker ikke-specifikke steder og inkuber med det primære antistof (se tabel S1 for detaljer) i 5% mælk i TBST (Tris-bufferet saltvand med Tween), vasketrin og sekundært antistof i TBST Incubate. Inkuber med primært antistof natten over ved +4°C. Efter vask påføres det sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Efterfølgende blev den samme belastning bekræftet ved at inkubere det samme blot med et anti-β-actin-antistof. Detektion ved konvertering til kemiluminescens og forstærkning af kemiluminescens (GE Healthcare).
Neuronerne, der tidligere var blevet podet på dækglas, blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA)/PBS på det angivne tidspunkt ved stuetemperatur i 10 minutter. Dækglassene blev først permeeret med 0,1% Triton X-100/PBS i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter i blokeringsbuffer [3% bovint serumalbumin (BSA)/PBS]. På den anden dag blev dækglassene vasket med blokeringsbuffer og inkuberet med det passende fluorofor-konjugerede sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur; til sidst blev prøverne vasket grundigt i PBS med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), der blev modfarvet og derefter fikseret på mikroskopglasset med Aqua-Poly/Mount.
Mus (hanner og hunner) blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af ketamin (130 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) og administreret subkutant med carprofen analgetikum (5 mg/kg). De blev placeret i et stereotaktisk instrument (Kopf) udstyret med en varm pude. Eksponér kraniet, og brug et tandbor til at udtynde den del af cerebellarbarken, der svarer til mis-knoglen (fra lambda: hale 1,8, lateral 1, svarende til lobuli IV og V). Brug en buet sprøjtenål ​​til forsigtigt at lave et lille hul i kraniet for at undgå at forstyrre vaskulaturen nedenunder. Derefter indsættes den tyndt trukne glaskapillær langsomt i mikrohullet (fra -1,3 til -1 på den ventrale side af dura mater), og 200 til 300 nl AAV injiceres i mikroinjektoren (Narishige) med manuelle sprøjter (Narishige) flere gange ved lavt tryk over en periode på 10 til 20 minutter. Efter infusionen placeres kapillærrøret i yderligere 10 minutter for at lade virussen sprede sig fuldstændigt. Efter kapillærrørene er trukket ud, sys huden omhyggeligt for at minimere sårbetændelse og lade dyret komme sig. Dyrene blev behandlet med smertestillende midler (caspofen) i flere dage efter operationen, i hvilken periode deres fysiske tilstand blev nøje overvåget, og derefter blev de aflivet på det angivne tidspunkt. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med europæiske, nationale og institutionelle retningslinjer og blev godkendt af LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Dyrene blev bedøvet med ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), og hjertet blev først perfunderet med 0,1 M PBS og derefter med 4% PFA i PBS. Vævet blev dissekeret og fikseret i 4% PFA/PBS natten over ved 4°C. En vibrerende kniv (Leica Microsystems GmbH, Wien, Østrig) blev brugt til at fremstille sagittale snit (50 μm tykke) fra den fikserede hjerne i PBS. Medmindre andet er angivet, blev farvning af fritflydende snit udført som beskrevet ovenfor (13) ved stuetemperatur og omrøring. Kort sagt blev de opnåede snit først permeabiliseret med 0,5% Triton X-100/PBS i 15 minutter ved stuetemperatur; for nogle epitoper (Pcx og Shmt2) blev snittene opvarmet i 25 minutter i tris-EDTA-buffer ved 80°C (pH 9) i stedet for dette trin. Derefter blev snittene inkuberet med primært antistof (se tabel S1) i blokeringsbuffer (3% BSA/PBS) ved 4°C natten over under omrøring. Næste dag blev snittene vasket med blokeringsbuffer og inkuberet med det passende fluorofor-konjugerede sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur; til sidst blev snittene vasket grundigt i PBS, modfarvet med DAPI og derefter fikseret med AquaPolymount på et objektglas.
Et laserscanningskonfokalmikroskop (TCS SP8-X eller TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) udstyret med en hvidlyslaser og en 405-diode ultraviolet laser blev brugt til at afbilde prøven. Ved at excitere fluoroforen og opsamle signalet med Hybrid Detector (HyDs) blev LAS-X-software brugt til at indsamle stablede billeder i overensstemmelse med Nyquist-sampling i sekventiel tilstand: for ikke-kvantitative paneler er det meget dynamiske signaler (for eksempel i somatiske celler og dendritter) (mtYFP). Brug HyD til at detektere antallet af PN'er i BrightR-tilstand). Gating fra 0,3 til 6 ns anvendes for at reducere baggrundsstråling.
Realtidsbilleddannelse af sorterede celler. Efter sortering i Neurobasal-A-medium indeholdende 1% B27-tilskud og 0,5 mM GlutaMax blev cellerne straks podet på poly-l-lysin-coatede objektglas (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalognummer 80826). Derefter blev de holdt ved 37°C og 5% CO2 i 1 time for at lade cellerne bundfælde sig. Realtidsbilleddannelse blev udført på et Leica SP8 laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med en hvid laser, HyD, 63×[1,4 numerisk apertur (NA)] olieobjektivlinse og et varmetrin.
Musen blev hurtigt bedøvet med kuldioxid og halshugget, hjernen blev hurtigt fjernet fra kraniet og skåret i 200 μm tykke (til 13C-mærkningseksperimentet) eller 275 μm tykke (til to fotoneksperimenter) sagittale snit fyldt med følgende materialer. Iscremen (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) er fyldt med følgende stoffer: 125 mM iskold, kulstofmættet (95% O2 og 5% CO2) lav Ca2 + kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 0,5 mM CaCl2 og 3,5 mM MgCl2 (osmotisk tryk på 310 til 330 mmol). Overfør de opnåede hjerneskiver til et præinkubationskammer indeholdende højere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 og 310 til 320 mmol).
Under billeddannelsesprocessen blev skiverne flyttet til et dedikeret billeddannelsesrum, og eksperimentet blev udført under kontinuerlig ACSF-perfusion ved en konstant temperatur på 32° til 33°C. Et multifotonlaserscanningsmikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) udstyret med en Leica 25x objektivlinse (NA 0,95, vand) og Ti:Sapphire-laser (Chameleon Vision II, Coherent) blev anvendt til skivebilleddannelse. FLIM-modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM af Grx1-roGFP2. Ændringerne i den cytoplasmatiske redoxtilstand af PN'er blev målt med to-foton FLIM i sagittale hjerneskiver, hvor Grx1-roGFP2-biosensoren målrettede PN'er. I PN-laget er optagelsesfeltet valgt omkring 50 til 80 μm under skiveoverfladen for at sikre, at der er en levedygtig PN (dvs. manglen på perlestruktur eller neuronale morfologiske ændringer langs dendritterne) og den dobbelt positive roGFP2-sensor og AAV-kodende shRNA PCx eller dens kontrolsekvens (som hver især udtrykker mCherry). Indsaml single-stable-billeder med 2x digital zoom [excitationsbølgelængde: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Detektion: intern HyD, fluoresceinisothiocyanat (FITC) filtergruppe] og billedgennemsnit inden for 2 til 3 minutter anvendes for at sikre, at der indsamles nok fotoner (1000 fotoner i alt) til kurvetilpasning. Følsomheden af ​​Grx1-roGFP2-proben og verifikationen af ​​FLIM-betingelser blev udført ved at overvåge levetidsværdien af ​​roGFP2, når der blev tilsat eksogent 10 mM H2O2 til perfusions-ACSF'en (for at maksimere oxidation, hvilket resulterer i øget levetid), og derefter tilsat 2 mM dithiothreitol (minimerer reduktionsgraden, hvilket resulterer i et fald i levetiden) (Figur S8, D til G). Brug FLIMfit 5.1.1-software til at analysere de opnåede resultater, tilpas den enkelte eksponentielle henfaldskurve for hele billedet til den målte IRF (instrumentresponsfunktion), og χ2 er cirka 1. For at beregne levetiden for en enkelt PN blev masken omkring nervelegemet tegnet manuelt, og den gennemsnitlige levetid i hver maske blev brugt til kvantificering.
Mitokondriepotentialanalyse. Efter at den akutte sektion var blevet inkuberet med 100 nM TMRM direkte tilsat den perfunderede ACSF i 30 minutter, blev ændringerne i mitokondriepotentialet af PN'er målt med et to-fotonmikroskop. TMRM-billeddannelse blev udført ved at excitere proben ved 920 nm og bruge intern HyD (tetramethylrhodaminisothiocyanat: 585/40 nm) til at indsamle signaler; ved at bruge den samme excitationsbølgelængde, men ved at bruge en anden intern HyD (FITC: 525/50) til at afbilde mtYFP. Brug ImageJ's Image Calculator-plugin til at evaluere mitokondriepotentialet på enkeltcelleniveau. Kort sagt bruges plugin-ligningen: signal = min (mtYFP, TMRM) til at identificere den mitokondrieregion, der viser TMRM-signalet i Purkinje Somali i det konfokale billede af den tilsvarende kanal. Derefter kvantificeres pixelområdet i den resulterende maske og normaliseres derefter på det tilsvarende tærskel-single-stak-billede af mtYFP-kanalen for at opnå den mitokondrielle fraktion, der viser mitokondriepotentialet.
Billedet blev dekonvolveret med Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. For de scannede billeder af fliser laves montagen af ​​en enkelt flise ved hjælp af den automatiske syalgoritme leveret af LAS-X software. Efter billedkalibrering skal du bruge ImageJ og Adobe Photoshop til at bearbejde billedet yderligere og justere lysstyrke og kontrast ensartet. Brug Adobe Illustrator til grafisk forberedelse.
mtDNA-fokusanalyse. Antallet af mtDNA-læsioner blev kvantificeret på cerebellare sektioner mærket med antistoffer mod DNA ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Hvert målområde blev oprettet for cellekroppen og kernen i hver celle, og det respektive område blev beregnet ved hjælp af Multi Measure plug-in'et (ImageJ-software). Træk kernarealet fra cellekroppens område for at opnå det cytoplasmatiske område. Endelig blev Analyze Particles plug-in'et (ImageJ-software) brugt til automatisk at kvantificere de cytoplasmatiske DNA-punkter, der indikerer mtDNA på tærskelbilledet, og de opnåede resultater blev normaliseret til PN-gennemsnittet for CTRL-mus. Resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal nukleosider pr. celle.
Proteinekspressionsanalyse. Brug ImageJs Image Calculator-plugin til at evaluere proteinekspression i PN på enkeltcelleniveau. Kort sagt identificeres den mitokondrielle region, der viser immunreaktivitet over for et bestemt antistof i Purkina, i det enkeltlags konfokale billede af den tilsvarende kanal gennem ligningen: signal = min (mtYFP, antistof). Derefter kvantificeres pixelområdet i den resulterende maske og normaliseres derefter på det tilsvarende tærskel-enkeltstackbillede af mtYFP-kanalen for at opnå den mitokondrielle fraktion af det viste protein.
Analyse af Purkinje-celletæthed. Cell Counter-plugin'et til ImageJ blev brugt til at evaluere Purkinje-tætheden ved at dividere antallet af optalte Purkinje-celler med længden af ​​den lillehjerne-ring, der er optaget af de optalte celler.
Prøveforberedelse og -indsamling. Hjernerne fra kontrolgruppen og Mfn2cKO-musene blev fikseret i 2% PFA/2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB), og derefter blev koronale sektioner fremstillet ved hjælp af ciliater (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Østrig) (tykkelse 50 til 60 μm). Derefter blev de fikseret i PB-buffer i 1% os-tetraoxid og 1,5% kaliumferrocyanid ved stuetemperatur i 1 time. Sektionerne blev vasket tre gange med destilleret vand og derefter farvet med 70% ethanol indeholdende 1% uranylacetat i 20 minutter. Sektionerne blev derefter dehydreret i graderet alkohol og indlejret i Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxyharpiks (Electron Microscopy Sciences, katalognummer 14040) mellem siliciumbelagte objektglas og endelig polymeriseret i ovnen ved 60°C i 48 timer. Området med lillehjernebark blev udvalgt, og 50 nm ultratynde snit blev skåret på Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Østrig) og optaget på et 2×1 mm kobberspaltegitter belagt med polystyrenfilm. Snittene blev farvet med en opløsning af 4% uranylacetat i H2O i 10 minutter, vasket med H2O flere gange, derefter med Reynolds-blycitrat i H2O i 10 minutter og derefter vasket med H2O flere gange. Mikrofotografier blev taget med et transmissionselektronmikroskop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved hjælp af et TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitalkamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Tyskland).
For mus inficeret med AAV blev hjernen adskilt og skåret i et 1 mm tykt sagittalt snit, og lillehjernen blev undersøgt ved hjælp af et fluorescensmikroskop for at identificere den AAV-inficerede ring (dvs. mCherry-ekspression). Kun eksperimenter, hvor AAV-injektion resulterer i en meget høj transduktionseffektivitet af Purkinje-cellelaget (dvs. næsten hele laget) i mindst to på hinanden følgende lillehjerne-ringe, anvendes. Den AAV-transducerede løkke blev mikrodissekeret til fiksering natten over (4% PFA og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M cocoatbuffer) og viderebehandlet. Til EPON-indlejring blev det fikserede væv vasket med 0,1 M natriumcocoatbuffer (Applichem) og inkuberet med 2% OsO4 (osO4, Science Services; Caco) i 0,1 M natriumcocoatbuffer (Applichem) i 4 timer, derefter vasket i 2 timer. Gentag 3 gange med 0,1 M cocamidebuffer. Derefter blev den stigende serie af ethanol anvendt til at inkubere hver ethanolopløsning ved 4°C i 15 minutter for at dehydrere vævet. Vævet blev overført til propylenoxid og inkuberet natten over i EPON (Sigma-Aldrich) ved 4°C. Anbring vævet i frisk EPON ved stuetemperatur i 2 timer, og indlejr det derefter ved 62°C i 72 timer. Brug en ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) og en diamantkniv (Diatome, Biel, Schweiz) til at skære 70 nm ultratynde snit, og farv med 1,5% uranylacetat i 15 minutter ved 37°C, og farv med blycitratopløsning i 4 minutter. Elektronmikrografierne blev taget ved hjælp af et JEM-2100 Plus transmissionselektronmikroskop (JEOL) udstyret med Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) og DigitalMicrograph-software (Gatan). Til analyse blev elektronmikrografer erhvervet med 5000× eller 10.000× digital zoom.
Morfologisk analyse af mitokondrier. For alle analyser blev konturerne af de enkelte mitokondrier manuelt skitseret i digitale billeder ved hjælp af ImageJ-software. Forskellige morfologiske parametre analyseres. Mitokondrietætheden udtrykkes som en procentdel opnået ved at dividere det samlede mitokondrielle areal af hver celle med cytoplasmaarealet (cytoplasmaareal = celleareal-cellekerneareal) × 100. Rundheden af ​​mitokondrier beregnes med formlen [4π∙(areal/omkreds 2)]. Mitokondriernes ista-morfologi blev analyseret og opdelt i to kategorier ("rørformede" og "blisterformede") i henhold til deres primære former.
Analyse af antal og tæthed af autofagosomer/lysosomer. Brug ImageJ-softwaren til manuelt at skitsere konturerne af hvert autofagosom/lysosom i det digitale billede. Autofagosom-/lysosomarealet udtrykkes som en procentdel beregnet ved at dividere det samlede autofagosom-/lysosomstrukturareal for hver celle med cytoplasmaarealet (cytoplasmaareal = celleareal-kerneareal) × 100. Tætheden af ​​autofagosomer/lysosomer beregnes ved at dividere det samlede antal med antallet af autofagosom-/lysosomstrukturer pr. celle (udtrykt i cytoplasmaareal) (cytoplasmatisk areal = celleareal-kerneareal).
Mærkning til akut sektionering og prøveforberedelse. Til eksperimenter, der kræver glukosemærkning, overføres de akutte hjerneskiver til et præinkubationskammer, som indeholder mættet kulstof (95% O2 og 5% CO2), ACSF med højt Ca2+-indhold (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2, justeret til pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), hvor glukose er 13C6-glukosesubstitution (Eurisotop, katalognummer CLM-1396). For eksperimenter, der kræver pyruvatmærkning, overføres de akutte hjerneskiver til højere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 og tilsættes 2,0 mM MgCl2, justeres til pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), og der tilsættes 1 mM 1-[1-13C]pyruvat (Eurisotop, katalognummer CLM-1082). Inkuber snittene i 90 minutter ved 37°C. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev snittene hurtigt vasket med en vandig opløsning (pH 7,4) indeholdende 75 mM ammoniumcarbonat og derefter homogeniseret i 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): methanol:vand. Efter at snittene var blevet inkuberet på is i 30 minutter, blev prøverne centrifugeret ved 21.000 g i 10 minutter ved 4 °C, og den klare supernatant blev tørret i en SpeedVac-koncentrator. Den resulterende tørrede metabolitpellet blev opbevaret ved -80 °C indtil analyse.
Væskekromatografi-massespektrometri-analyse af 13C-mærkede aminosyrer. Til væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-analyse blev metabolitpelleten resuspenderet i 75 μl vand af LC-MS-kvalitet (Honeywell). Efter centrifugering ved 21.000 g i 5 minutter ved 4 °C blev 20 μl af den klarede supernatant anvendt til aminosyrefluxanalyse, mens resten af ​​ekstraktet straks blev anvendt til anionanalyse (se nedenfor). Aminosyreanalyse blev udført ved hjælp af den tidligere beskrevne benzoylchlorid-derivatiseringsprotokol (55, 56). I det første trin blev 10 μl 100 mM natriumcarbonat (Sigma-Aldrich) tilsat til 20 μl metabolitekstrakt, og derefter blev 10 μl 2% benzoylchlorid (Sigma-Aldrich) tilsat til LC-kvalitet ACN. Prøven blev kortvarigt vortexet og derefter centrifugeret ved 21.000 g i 5 minutter ved 20 °C. Den klarede supernatant blev overført til et 2 ml autosampler-hætteglas med en konisk glasindsats (200 μl volumen). Prøverne blev analyseret ved hjælp af Acquity iClass ultra-højtydende LC-system (Waters) forbundet til Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) højopløsningspræcisionsmassespektrometer (Thermo Fisher Scientific). Til analyse blev 2 μl af den derivatiserede prøve injiceret i en 100 × 1,0 mm højstyrke silica T3-søjle (Waters) indeholdende 1,8 μm partikler. Flowhastigheden er 100 μl/min, og buffersystemet består af buffer A (10 mM ammoniumformiat og 0,15% myresyre i vand) og buffer B (ACN). Gradienten er som følger: 0%B ved 0 minutter; 0%B. 0 til 15% B ved 0 til 0,1 minutter; 15 til 17% B ved 0,1 til 0,5 minutter; B ved 17 til 55% ved 0,5 til 14 minutter; B ved 55 til 70% ved 14 til 14,5 minutter; ved 14,5 til 70 til 100% B ved 18 minutter; 100% B ved 18 til 19 minutter; 100 til 0% B ved 19 til 19,1 minutter; 0% B ved 19,1 til 28 minutter (55, 56). QE-HF-massespektrometeret fungerer i positiv ioniseringstilstand med et masseområde på m/z (masse/ladningsforhold) på 50 til 750. Den anvendte opløsning er 60.000, og det opnåede forstærkningskontrol-ionmål (AGC) er 3×106, og den maksimale iontid er 100 millisekunder. Den opvarmede elektrosprayioniseringskilde (ESI) fungerer ved en sprayspænding på 3,5 kV, en kapillærtemperatur på 250°C, en kappeluftstrøm på 60 AU (vilkårlige enheder) og en hjælpeluftstrøm på 20 AU til 250°C. S-linsen er indstillet til 60 AU.
Anionkromatografi-MS-analyse af 13C-mærkede organiske syrer. Det resterende metabolitbundfald (55 μl) blev analyseret ved hjælp af et Dionex-ionkromatografisystem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) forbundet til et QE-HF-massespektrometer (Thermo Fisher Scientific). Kort sagt blev 5 μl metabolitekstrakt injiceret i en Dionex IonPac AS11-HC-søjle udstyret med HPLC (2 mm × 250 mm, partikelstørrelse 4 μm, Thermo Fisher Scientific) i push-in partial loop-tilstand med et fyldningsforhold på 1. Dionex IonPac AG11-HC beskyttelsessøjle (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Søjletemperaturen holdes ved 30 °C, og autosampleren indstilles til 6 °C. Brug en kaliumhydroxidpatron forsynet med deioniseret vand til at generere en kaliumhydroxidgradient gennem eluentgeneratoren. Separation af metabolitter ved en flowhastighed på 380 μl/min, under anvendelse af følgende gradient: 0 til 3 minutter, 10 mM KOH; 3 til 12 minutter, 10 til 50 mM KOH; 12 til 19 minutter, 50 til 100 mM KOH; 19 til 21 minutter, 100 mM KOH; 21 til 21,5 minutter, 100 til 10 mM KOH. Kolonnen blev re-ækvilibreret under 10 mM KOH i 8,5 minutter.
De eluerede metabolitter kombineres med en 150 μl/min isopropanol-tilskudsstrøm efter kolonnen og ledes derefter til et højopløsningsmassespektrometer, der opererer i negativ ioniseringstilstand. MS overvåger masseområdet fra m/z 50 til 750 med en opløsning på 60.000. AGC'en er indstillet til 1×106, og den maksimale iontid holdes på 100 ms. Den opvarmede ESI-kilde blev drevet ved en sprayspænding på 3,5 kV. De andre indstillinger for ionkilden er som følger: kapillærtemperatur 275°C; kappegasstrømning, 60 AU; hjælpegasstrømning, 20 AU ved 300°C og S-linseindstilling til 60 AU.
Dataanalyse af 13C-mærkede metabolitter. Brug TraceFinder-software (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) til dataanalyse af isotopforholdet. Identiteten af ​​hver forbindelse blev verificeret af en pålidelig referenceforbindelse og analyseret uafhængigt. For at udføre isotopberigelsesanalyse blev arealet af det ekstraherede ionkromatogram (XIC) for hver 13C-isotop (Mn) ekstraheret fra [M + H]+, hvor n er kulstoftallet for målforbindelsen, der bruges til at analysere aminosyrer, eller [MH]+, der bruges til at analysere anioner. Massenøjagtigheden af ​​XIC er mindre end fem dele per million, og nøjagtigheden af ​​RT er 0,05 minutter. Berigelsesanalysen udføres ved at beregne forholdet mellem hver detekteret isotop og summen af ​​alle isotoper af den tilsvarende forbindelse. Disse forhold er angivet som procentværdier for hver isotop, og resultaterne udtrykkes som molær procentberigelse (MPE), som tidligere beskrevet (42).
Den frosne neuronpellet blev homogeniseret i iskold 80% methanol (v/v), vortexet og inkuberet ved -20°C i 30 minutter. Vortex-bland prøven igen og omrør ved +4°C i 30 minutter. Prøven blev centrifugeret ved 21.000 g i 5 minutter ved 4°C, og derefter blev den resulterende supernatant opsamlet og tørret ved hjælp af en SpeedVac-koncentrator ved 25°C til efterfølgende analyse. Som beskrevet ovenfor blev LC-MS-analyse udført på aminosyrerne i de sorterede celler. Ved hjælp af TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) blev dataanalyse udført ved hjælp af den monoisotopiske masse af hver forbindelse. Kvantilnormalisering af metabolitdata blev udført ved hjælp af preprocessCore-softwarepakken (57).
Forberedelse af snit. Musen blev hurtigt bedøvet med kuldioxid og halshugget, hjernen blev hurtigt fjernet fra kraniet, og den isfyldte vibrerende kniv (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) blev brugt til at skære den i sagittale snit på 300 til 375 μm. Kold kulstofforgasning (95% O2 og 5% CO2) Lavt Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 og 6,0 mM MgCl2. Juster til pH 7,4 og 310 til 330 mOsm). Overfør de opnåede hjerneskiver til et kammer indeholdende højere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 mM CaCl2 og mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 og 310 til 320 mOsm). Opbevar skiverne i 20 til 30 minutter, så de kan gendannes før optagelse.
optagelse. Et mikroskopbord udstyret med et fast optagekammer og en 20x vandimmersionsobjektivlinse (Scientifica) blev anvendt til alle optagelser. De formodede Purkinje-celler blev identificeret ved (i) kropsstørrelse, (ii) lillehjernens anatomiske placering og (iii) ekspression af det fluorescerende mtYFP-reportergen. Patchpipetten med en spidsmodstand på 5 til 11 megohm trækkes ud af en borsilikatglaskapillar (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Tyskland) og en horisontal pipette fra Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Alle optagelser blev udført af ELC-03XS npi patch clamp forstærker (npi electronic GmbH, Tam, Tyskland), som blev styret af softwaren Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Eksperimentet blev optaget med en samplingshastighed på 12,5 kHz. Signalet filtreres med to kortpas-Bessel-filtre med afskæringsfrekvenser på henholdsvis 1,3 og 10 kHz. Membranens og pipettens kapacitans kompenseres af kompensationskredsløbet ved hjælp af forstærkeren. Alle eksperimenter blev udført under styring af et Orca-Flash 4.0-kamera (Hamamatsu, Gerden, Tyskland), som blev styret af Hokawo-softwaren (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Tyskland).
Rutinemæssig helcellekonfiguration og -analyse. Umiddelbart før optagelse fyldes pipetten med den interne opløsning indeholdende følgende stoffer: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumgluconat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosintrifosfat (GTP) (Na) og 10,0 mM kreatininfosfat blev justeret til pH 7,25, og det osmotiske tryk var 290 mOsm (sukrose). Umiddelbart efter påføring af en kraft på 0 pA for at sprænge membranen blev hvilemembranpotentialet målt. Indgangsmodstanden måles ved at påføre hyperpolariserede strømme på -40, -30, -20 og -10 pA. Mål størrelsen af ​​spændingsresponset, og brug Ohms lov til at beregne indgangsmodstanden. Spontan aktivitet blev registreret i en spændingstang i 5 minutter, og sPSC blev identificeret og målt i Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ved hjælp af et semiautomatisk genkendelsesskript. IV-kurven og steady-state-strømmen måles ved at fastspænde batteriet ved forskellige potentialer (startende fra -110 mV) og øge spændingen i trin på 5 mV. Produktionen af ​​AP blev testet ved at anvende en depolariserende strøm. Fastspænd cellen ved -70 mV, mens der anvendes en depolariserende strømpuls. Juster trinstørrelsen for hver optagelsesenhed separat (10 til 60 pA). Beregn den maksimale AP-frekvens ved manuelt at tælle de pulsspidser, der forårsager den højeste AP-frekvens. AP-tærsklen analyseres ved hjælp af den anden afledte af den depolarisationspuls, der først udløser en eller flere AP'er.
Konfiguration og analyse af perforeret patch. Udfør perforeret patch-optagelse ved hjælp af standardprotokoller. Brug en ATP- og GTP-fri pipette, der ikke indeholder følgende ingredienser: 128 mM gluconat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA og 2 mM MgCl2, og juster til pH 7,2 (ved hjælp af KOH). ATP og GTP udelades fra den intracellulære opløsning for at forhindre ukontrolleret permeabilitet af cellemembranen. Patch-pipetten fyldes med en amphotericinholdig intern opløsning (ca. 200 til 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) for at opnå en stanset patch-optagelse. Amphotericin blev opløst i dimethylsulfoxid (slutkoncentration: 0,1 til 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Den anvendte DMSO-koncentration havde ingen signifikant effekt på de undersøgte neuroner. Under stanseprocessen blev kanalmodstanden (Ra) kontinuerligt overvåget, og eksperimentet blev startet, efter at amplituden af ​​Ra og AP var stabiliseret (20-40 minutter). Spontan aktivitet måles i en spændings- og/eller strømtang i 2 til 5 minutter. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) og GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). USA). For at identificere spontane AP'er anvendes IgorPros NeuroMatic v3.0c plugin. Identificer automatisk AP'er ved hjælp af en given tærskel, som justeres individuelt for hver post. Ved hjælp af spike-intervallet bestemmes spike-frekvensen med den maksimale øjeblikkelige spike-frekvens og den gennemsnitlige spike-frekvens.
PN-isolering. Ved at tilpasse sig den tidligere publicerede protokol blev PN'er oprenset fra musens lillehjerne på et bestemt stadie (58). Kort sagt blev lillehjernen dissekeret og hakket i iskoldt dissociationsmedium [uden HBSS Ca2+ og Mg2+, suppleret med 20 mM glukose, penicillin (50 U/ml) og streptomycin (0,05 mg/ml)], og derefter blev mediet fordøjet i papain [HBSS, suppleret med 1-cystein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) og deoxyribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Behandl i 30 minutter ved 30°C. Vask først vævene i HBSS-medium indeholdende æggeslim (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) og DNase (0,1 mg/ml) ved stuetemperatur for at forhindre enzymatisk fordøjelse, og derefter i HBSS-mediet indeholdende 20 mM glukose. Forsigtigt formales HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0,05 mg/ml) og DNase (0,1 mg/ml) for at frigøre enkeltceller. Den resulterende cellesuspension blev filtreret gennem en 70 μm cellesi, hvorefter cellerne blev pelleteret ved centrifugering (1110 rpm, 5 minutter, 4°C) og resuspenderet i sorteringsmedium [HBSS, suppleret med 20 mM glukose, 20% føtalt bovint serum, penicillin (50 U/ml) og streptomycin (0,05 mg/ml)]; evaluer cellernes levedygtighed med propidiumiodid, og juster celletætheden til 1×10⁶ til 2×10⁶ celler/ml. Før flowcytometri blev suspensionen filtreret gennem en 50 μm cellefilter.
Flowcytometer. Cellesortering blev udført ved 4°C ved hjælp af en FACSAria III-maskine (BD Biosciences) og FACSDiva-software (BD Biosciences, version 8.0.1). Cellesuspensionen blev sorteret ved hjælp af en 100 μm dyse under et tryk på 20 psi med en hastighed på ~2800 hændelser/sek. Da traditionelle gatingkriterier (cellestørrelse, bimodal diskrimination og spredningsegenskaber) ikke kan sikre korrekt isolering af PN fra andre celletyper, fastsættes gatingstrategien baseret på direkte sammenligning af YFP-intensiteten og autofluorescensen i mitoYFP+ ​​og kontrol-mitoYFP-mus. YFP exciteres ved at bestråle prøven med en 488 nm laserlinje, og signalet detekteres ved hjælp af et 530/30 nm båndpasfilter. Hos mitoYFP+ ​​mus bruges den relative styrke af Rosa26-mitoYFP-reportergenet også til at skelne mellem neuronale krops- og axonfragmenter. 7-AAD exciteres med en 561 nm gul laser og detekteres med et 675/20 nm båndpasfilter for at udelukke døde celler. For at adskille astrocytter samtidig blev cellesuspensionen farvet med ACSA-2-APC, derefter blev prøven bestrålet med en 640 nm laserlinje, og et 660/20 nm båndpasfilter blev brugt til at detektere signalet.
De indsamlede celler blev pelleteret ved centrifugering (1110 rpm, 5 minutter, 4°C) og opbevaret ved -80°C indtil brug. Mfn2cKO-mus og deres kuldhvalpe klassificeres samme dag for at minimere proceduremæssig variabilitet. FACS-datapræsentation og -analyse blev udført ved hjælp af FlowJo-software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Som nævnt ovenfor (59) anvendes realtids-PCR til at isolere DNA fra de sorterede neuroner til efterfølgende mtDNA-kvantificering. Lineariteten og tærskelfølsomheden blev initialt testet ved at køre qPCR på forskellige antal celler. Kort sagt, opsaml 300 PN i en lysisbuffer bestående af 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 og proteinase K (200 ng/ml) og inkuber ved 55°C i 120 minutter. Cellerne blev yderligere inkuberet ved 95°C i 10 minutter for at sikre fuldstændig inaktivering af proteinase K. Ved hjælp af en TaqMan-probe (Thermo Fisher) specifik for mt-Nd1 blev mtDNA målt ved semi-kvantitativ PCR i 7900HT Real-Time PCR-systemet (Thermo Fisher Scientific). Science, katalognummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalognummer AIVI3E8) og 18S (Thermo Fisher Scientific, katalognummer Hs99999901_s1) gener.
Forberedelse af proteomprøve. Ved at opvarme opløsningen ved 95 °C i 10 minutter og sonikere i lysisbufferen [6 M guanidinchlorid, 10 mM tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid, 10 mM chloracetamid og 100 mM tris-Lyse frosne neuronpellets i HCl]. På Bioruptor (Diagenode) i 10 minutter (30 sekunders puls / 30 sekunders pauseperiode). Prøven blev fortyndet 1:10 i 20 mM tris-HCl (pH 8,0), blandet med 300 ng trypsin-guld (Promega) og inkuberet natten over ved 37 °C for at opnå fuldstændig fordøjelse. På den anden dag blev prøven centrifugeret ved 20.000 g i 20 minutter. Supernatanten blev fortyndet med 0,1% myresyre, og opløsningen blev afsaltet med hjemmelavede StageTips. Prøven blev tørret i et SpeedVac-instrument (Eppendorf-koncentrator plus 5305) ved 45 °C, og derefter blev peptidet suspenderet i 0,1 % myresyre. Alle prøver blev fremstillet samtidigt af den samme person. For at analysere astrocytprøverne blev 4 μg afsaltede peptider mærket med et tandem-massemærke (TMT10plex, katalognummer 90110, Thermo Fisher Scientific) med et forhold mellem peptid og TMT-reagens på 1:20. Til TMT-mærkning blev 0,8 mg TMT-reagens resuspenderet i 70 μl vandfri ACN, og det tørrede peptid blev rekonstitueret i 9 μl 0,1 M TEAB (triethylammoniumbicarbonat), hvortil 7 μl TMT-reagens i ACN blev tilsat. Koncentrationen var 43,75 %. Efter 60 minutters inkubation blev reaktionen afbrudt med 2 μl 5 % hydroxylamin. De mærkede peptider blev opsamlet, tørret, resuspenderet i 200 μl 0,1% myresyre (FA), delt i to og derefter afsaltet ved hjælp af hjemmelavede StageTips. Ved hjælp af en UltiMate 3000 ultra højtydende væskekromatograf (UltiMate 3000 ultra højtydende væskekromatograf) blev en af ​​de to halvdele fraktioneret på en 1 mm x 150 mm Acquity kromatografisk søjle fyldt med 130 Å1,7 μm C18-partikler (Waters, katalognr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separer peptiderne ved en flowhastighed på 30 μl/min, separer fra 1% til 50% buffer B i 85 minutter med en trinvis gradient på 96 minutter, fra 50% til 95% buffer B i 3 minutter, derefter 8 minutter for 95% buffer B; Buffer A er 5% ACN og 10 mM ammoniumbicarbonat (ABC), og buffer B er 80% ACN og 10 mM ABC. Indsaml fraktioner hvert 3. minut, og kombiner dem i to grupper (1 + 17, 2 + 18 osv.), og tør dem i en vakuumcentrifuge.
LC-MS/MS-analyse. Til massespektrometri blev peptiderne (nummer r119.aq) separeret på en 25 cm, 75 μm indre diameter PicoFrit-analysesøjle (ny objektivlinse, varenummer PF7508250) udstyret med 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), brug EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Søjlen blev holdt ved 50°C. Buffer A og B er henholdsvis 0,1% myresyre i vand og 0,1% myresyre i 80% ACN. Peptiderne blev separeret fra 6% til 31% buffer B i 65 minutter og fra 31% til 50% buffer B i 5 minutter med en gradient på 200 nl/min. De eluterede peptider blev analyseret på et Orbitrap Fusion massespektrometer (Thermo Fisher Scientific). Peptidforløber m/z-måling udføres med en opløsning på 120.000 i området 350 til 1500 m/z. Ved at bruge 27% normaliseret kollisionsenergi udvælges den stærkeste forløber med en ladningstilstand på 2 til 6 til højenergi C-fældedissociations (HCD)-spaltning. Cyklustiden er sat til 1 s. M/z-værdien af ​​peptidfragmentet blev målt i ionfælden ved hjælp af det mindste AGC-mål på 5×104 og den maksimale injektionstid på 86 ms. Efter fragmentering blev forløberen placeret på den dynamiske udelukkelsesliste i 45 s. TMT-mærkede peptider blev separeret på en 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-søjle (Thermo Fisher Scientific, katalognummer 164942), og migrationsspektrene blev analyseret på et Orbitrap Lumos Tribrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) udstyret med højfelts asymmetriske bølgeformioner (FAIMS)-udstyr (Thermo Fisher Scientific), der opererer ved to kompensationsspændinger på -50 og -70 V. MS3 valgt baseret på synkroniseringsforløberen anvendes til måling af TMT-rapportionsignalet. Peptidseparationen blev udført på EASY-nLC 1200 ved hjælp af en 90% lineær gradienteluering med en bufferkoncentration på 6% til 31%; buffer A var 0,1% FA, og buffer B var 0,1% FA og 80% ACN. Den analytiske søjle opereres ved 50°C. Brug FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) til at opdele den originale fil i henhold til FAIMS-kompensationsspændingen.
Proteinidentifikation og kvantificering. Ved hjælp af den integrerede Andromeda-søgemaskine blev de originale data analyseret ved hjælp af MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ud over Cre-rekombinase- og YFP-sekvenserne fra Aequorea victoria blev peptidfragmentspektre søgt efter den kanoniske sekvens og isoformsekvens af musereferenceproteomet (Proteom-ID UP000000589, downloadet fra UniProt i maj 2017). Methioninoxidation og protein N-terminal acetylering blev indstillet som variable modifikationer; cysteincarbamoylmethylering blev indstillet som faste modifikationer. Fordøjelsesparametrene er indstillet til "specificitet" og "trypsin/P". Minimumsantallet af peptider og razorpeptider, der anvendes til proteinidentifikation, er 1; minimumsantallet af unikke peptider er 0. Under betingelserne for peptidkortmatchning var proteinidentifikationsraten 0,01. Indstillingen "Andet peptid" er aktiveret. Brug funktionen "match between runs" til at overføre succesfulde identifikationer mellem forskellige originale filer. Brug LFQ minimum ratio count 1 til label-free quantification (LFQ) (60). LFQ-intensiteten filtreres for mindst to gyldige værdier i mindst én genotypegruppe på hvert tidspunkt og ekstrapoleres fra en normalfordeling med en bredde på 0,0,3 og flyttes ned 1,8. Brug Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) og R (https://r-project.org/) til at analysere LFQ-resultaterne. En tovejs moderat t-test fra limma-softwarepakken blev brugt til differentiel ekspressionsanalyse (61). Eksplorativ dataanalyse udføres ved hjælp af ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally og pheatmap. De TMT-baserede proteomikdata blev analyseret ved hjælp af MaxQuant version 1.6.10.43. Søg efter rå proteomikdata fra UniProts humane proteomikdatabase, som blev downloadet i september 2018. Analysen inkluderer den isotoprenhedskorrektionsfaktor, der er leveret af producenten. Brug limma i R til differentiel ekspressionsanalyse. De originale data, databasesøgeresultaterne og dataanalysearbejdsgangen og resultaterne er alle gemt i ProteomeXchange-alliancen via PRIDE-partnerarkivet med datasætidentifikatoren PXD019690.
Funktionelle annotationer beriger analysen. Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN)-værktøjet blev brugt til at bestemme rigdommen af ​​de funktionelle annotationstermer i datasættet efter 8 uger (Figur 1). Kort sagt anvendes den kvantitative proteinliste, der er opnået fra LC-MS/MS (tandem massespektrometri) dataanalyse, med følgende filterkriterier: Mus musculus er valgt som art og baggrund, og kategorien viser, at P-værdien justeret af Benjamini for berigelse på 0,05 eller lavere anses for signifikant. For denne graf vises de fem største overskydende kategorier i hver klynge baseret på den justerede P-værdi. Ved hjælp af multipel t-test, der bruger Benjamini, Krieger og Yekutielis to-trins lineære boost-program (Q = 5%), udføres tidsforløbsproteinekspressionsanalyse på de vigtige kandidater, der er identificeret i hver kategori, og hver række analyseres separat. Der er ikke behov for at anvende en konsistent standardafvigelse.
For at sammenligne resultaterne af dette studie med publicerede databaser og generere et Venn-diagram i figur 1, kombinerede vi den kvantitative proteinliste med MitoCarta 2.0-annotationer (24). Brug onlineværktøjet Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) til at generere diagrammet.
For detaljerede oplysninger om de statistiske procedurer, der anvendes til proteomisk analyse, henvises til det tilsvarende afsnit under Materialer og metoder. For alle andre eksperimenter kan detaljerede oplysninger findes i den tilsvarende forklaring. Medmindre andet er angivet, er alle data udtrykt som middelværdi ± SEM, og alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 8.1.2 software.
For supplerende materiale til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillader brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, så længe den endelige anvendelse ikke er til kommerciel gevinst, og forudsætningen er, at det originale værk er korrekt. Reference.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at den ikke er spam. Vi indsamler ikke nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende, og til at forhindre automatisk spamindsendelse.
Af E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomisk analyse af dysfunktionelle neuroner viste, at metaboliske programmer aktiveres for at modvirke neurodegeneration.
Af E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomisk analyse af dysfunktionelle neuroner viste, at metaboliske programmer aktiveres for at modvirke neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheder forbeholdes. AAAS er partner med HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.