Artiklen er en del af forskningsemnet "Avancerede bioremedieringsteknologier og genbrugsprocesser for syntetiske organiske forbindelser (SOC). Se alle 14 artikler
Lavmolekylære polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) såsom naphthalen og substituerede naphthalener (methylnaphthalen, naphthoesyre, 1-naphthyl-N-methylcarbamat osv.) anvendes i vid udstrækning i forskellige industrier og er genotoksiske, mutagene og/eller kræftfremkaldende for organismer. Disse syntetiske organiske forbindelser (SOC'er) eller xenobiotika betragtes som prioriterede forurenende stoffer og udgør en alvorlig trussel mod det globale miljø og folkesundheden. Intensiteten af ​​menneskelige aktiviteter (f.eks. kulforgasning, olieraffinering, køretøjsemissioner og landbrugsmæssige anvendelser) bestemmer koncentrationen, skæbnen og transporten af ​​disse allestedsnærværende og persistente forbindelser. Ud over fysiske og kemiske behandlings-/fjernelsesmetoder er grønne og miljøvenlige teknologier såsom bioremediering, der anvender mikroorganismer, der er i stand til fuldstændigt at nedbryde POC'er eller omdanne dem til ikke-giftige biprodukter, fremkommet som et sikkert, omkostningseffektivt og lovende alternativ. Forskellige bakteriearter, der tilhører rækkerne Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia og Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus og Paenibacillus) og Actinobacteria (Rhodococcus og Arthrobacter) i jordens mikrobiota, har vist evnen til at nedbryde forskellige organiske forbindelser. Metaboliske studier, genomik og metagenomisk analyse hjælper os med at forstå den kataboliske kompleksitet og diversitet, der er til stede i disse simple livsformer, hvilket kan anvendes yderligere til effektiv bionedbrydning. Den langvarige eksistens af PAH'er har resulteret i fremkomsten af ​​nye nedbrydningsfænotyper gennem horisontal genoverførsel ved hjælp af genetiske elementer såsom plasmider, transposoner, bakteriofager, genomiske øer og integrative konjugative elementer. Systembiologi og genteknologi af specifikke isolater eller modelsamfund (konsortier) kan muliggøre omfattende, hurtig og effektiv bioremediering af disse PAH'er gennem synergistiske effekter. I denne gennemgang fokuserer vi på de forskellige metaboliske veje og diversitet, genetisk sammensætning og diversitet samt cellulære reaktioner/tilpasninger hos naftalen og substituerede naftalen-nedbrydende bakterier. Dette vil give økologisk information til feltanvendelse og belastningsoptimering for effektiv bioremediering.
Den hurtige udvikling af industrier (petrokemikalier, landbrug, lægemidler, tekstilfarvestoffer, kosmetik osv.) har bidraget til global økonomisk velstand og forbedret levestandard. Denne eksponentielle udvikling har resulteret i produktionen af ​​et stort antal syntetiske organiske forbindelser (SOC'er), som bruges til at fremstille forskellige produkter. Disse fremmede forbindelser eller SOC'er omfatter polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er), pesticider, herbicider, blødgørere, farvestoffer, lægemidler, organofosfater, flammehæmmere, flygtige organiske opløsningsmidler osv. De udledes i atmosfæren, akvatiske og terrestriske økosystemer, hvor de har flerdimensionelle påvirkninger, der forårsager skadelige virkninger på forskellige bioformer gennem ændring af fysisk-kemiske egenskaber og samfundsstruktur (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Mange aromatiske forurenende stoffer har stærke og destruktive virkninger på mange intakte økosystemer/biodiversitetshotspots (f.eks. koralrev, arktiske/antarktiske iskapper, høje bjergsøer, dybhavssedimenter osv.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Nylige geomikrobiologiske undersøgelser har vist, at aflejring af syntetisk organisk materiale (f.eks. aromatiske forurenende stoffer) og deres derivater på overfladerne af kunstige strukturer (bygget miljø) (f.eks. kulturarvssteder og monumenter lavet af granit, sten, træ og metal) accelererer deres nedbrydning (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Menneskelige aktiviteter kan intensivere og forværre den biologiske nedbrydning af monumenter og bygninger gennem luftforurening og klimaændringer (Liu et al. 2020). Disse organiske forurenende stoffer reagerer med vanddamp i atmosfæren og sætter sig på strukturen, hvilket forårsager fysisk og kemisk nedbrydning af materialet. Bionedbrydning er bredt anerkendt som uønskede ændringer i materialers udseende og egenskaber forårsaget af levende organismer, der påvirker deres bevaring (Pochon og Jaton, 1967). Yderligere mikrobiel aktivitet (metabolisme) af disse forbindelser kan reducere strukturel integritet, bevaringseffektivitet og kulturel værdi (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). På den anden side har mikrobiel tilpasning til og reaktion på disse strukturer i nogle tilfælde vist sig at være gavnlig, da de danner biofilm og andre beskyttende skorper, der reducerer hastigheden af ​​forfald/nedbrydning (Martino, 2016). Derfor kræver udviklingen af ​​effektive langsigtede bæredygtige bevaringsstrategier for sten-, metal- og træmonumenter en grundig forståelse af de vigtigste processer, der er involveret i denne proces. Sammenlignet med naturlige processer (geologiske processer, skovbrande, vulkanudbrud, plante- og bakteriereaktioner) resulterer menneskelige aktiviteter i frigivelse af store mængder polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) og andet organisk kulstof (OC) i økosystemer. Mange PAH'er, der anvendes i landbruget (insekticider og pesticider såsom DDT, atrazin, carbaryl, pentachlorphenol osv.), industrien (råolie, olieslam/affald, oliebaseret plast, PCB'er, blødgørere, rengøringsmidler, desinfektionsmidler, gasningsmidler, duftstoffer og konserveringsmidler), produkter til personlig pleje (solcremer, desinfektionsmidler, insektafvisende midler og polycykliske moskus) og ammunition (eksplosiver såsom 2,4,6-TNT), er potentielle xenobiotika, der kan påvirke planetens sundhed (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna og Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Denne liste kan udvides til at omfatte oliebaserede forbindelser (brændselsolier, smøremidler, asfaltener), bioplast med høj molekylvægt og ioniske væsker (Amde et al., 2015). Tabel 1 viser forskellige aromatiske forurenende stoffer og deres anvendelser i forskellige industrier. I de senere år er menneskeskabte emissioner af flygtige organiske forbindelser, såvel som kuldioxid og andre drivhusgasser, begyndt at stige (Dvorak et al., 2017). De menneskeskabte påvirkninger overstiger dog betydeligt de naturlige påvirkninger. Derudover fandt vi, at en række kemiske organiske forbindelser findes i mange miljøer og er blevet identificeret som nye forurenende stoffer med negative virkninger på biomer (Figur 1). Miljøagenturer som f.eks. United States Environmental Protection Agency (USEPA) har inkluderet mange af disse forurenende stoffer på deres prioritetsliste på grund af deres cytotoksiske, genotoksiske, mutagene og kræftfremkaldende egenskaber. Derfor er der behov for strenge bortskaffelsesregler og effektive strategier til affaldsbehandling/fjernelse fra forurenede økosystemer. Forskellige fysiske og kemiske behandlingsmetoder såsom pyrolyse, oxidativ termisk behandling, luftgennemstrømning, deponering, forbrænding osv. er ineffektive og dyre og genererer ætsende, giftige og vanskeligt behandlede biprodukter. Med den stigende globale miljøbevidsthed tiltrækker mikroorganismer, der er i stand til at nedbryde disse forurenende stoffer og deres derivater (såsom halogenerede, nitro-, alkyl- og/eller methyl-) sig stigende opmærksomhed (Fennell et al., 2004; Haritash og Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Brugen af ​​disse oprindelige kandidatmikroorganismer alene eller i blandede kulturer (kolonier) til fjernelse af aromatiske forurenende stoffer har fordele med hensyn til miljøsikkerhed, omkostninger, effektivitet, virkningsfuldhed og bæredygtighed. Forskere undersøger også integrationen af ​​mikrobielle processer med elektrokemiske redoxmetoder, nemlig bioelektrokemiske systemer (BES), som en lovende teknologi til behandling/fjernelse af forurenende stoffer (Huang et al., 2011). BES-teknologi har tiltrukket sig stigende opmærksomhed på grund af dens høje effektivitet, lave omkostninger, miljøsikkerhed, drift ved stuetemperatur, biokompatible materialer og evnen til at genvinde værdifulde biprodukter (f.eks. elektricitet, brændstof og kemikalier) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Fremkomsten af ​​højkapacitets genomsekventering og omics-værktøjer/metoder har givet et væld af ny information om genetisk regulering, proteomics og fluxomics af reaktionerne hos forskellige nedbrydende mikroorganismer. Kombinationen af ​​disse værktøjer med systembiologi har yderligere forbedret vores forståelse af udvælgelsen og finjusteringen af ​​​​målkataboliske veje i mikroorganismer (dvs. metabolisk design) for at opnå effektiv og virkningsfuld bionedbrydning. For at designe effektive bioremedieringsstrategier ved hjælp af egnede kandidatmikroorganismer er vi nødt til at forstå det biokemiske potentiale, metaboliske diversitet, genetiske sammensætning og økologi (autoøkologi/synækologi) hos mikroorganismer.
Fig. 1. Kilder og stoffer, der forårsager lavmolekylære PAH'er, gennem forskellige miljøer og faktorer, der påvirker biota. Stiplede linjer repræsenterer interaktioner mellem økosystemelementer.
I denne gennemgang har vi forsøgt at opsummere data om nedbrydning af simple PAH'er såsom naftalen og substituerede naftalener af forskellige bakterieisolater, der dækker metaboliske veje og diversitet, enzymer involveret i nedbrydning, gensammensætning/indhold og diversitet, cellulære reaktioner og forskellige aspekter af bioremediering. Forståelse af de biokemiske og molekylære niveauer vil hjælpe med at identificere egnede værtsstammer og deres videre genteknologi til effektiv bioremediering af sådanne prioriterede forurenende stoffer. Dette vil hjælpe med at udvikle strategier til etablering af stedspecifikke bakteriekonsortier for effektiv bioremediering.
Tilstedeværelsen af ​​et stort antal giftige og farlige aromatiske forbindelser (som opfylder Huckels regel 4n + 2π elektroner, n = 1, 2, 3, ...) udgør en alvorlig trussel mod forskellige miljømedier såsom luft, jord, sedimenter samt overfladevand og grundvand (Puglisi et al., 2007). Disse forbindelser har enkelte benzenringe (monocykliske) eller flere benzenringe (polycykliske) arrangeret i lineær, vinkelform eller klyngeform og udviser stabilitet (stabilitet/ustabilitet) i miljøet på grund af høj negativ resonansenergi og inertitet (inertitet), hvilket kan forklares ved deres hydrofobicitet og reducerede tilstand. Når den aromatiske ring yderligere erstattes af methyl- (-CH3), carboxyl- (-COOH), hydroxyl- (-OH) eller sulfonat- (-HSO3) grupper, bliver den mere stabil, har en stærkere affinitet for makromolekyler og er bioakkumulerende i biologiske systemer (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Nogle polycykliske aromatiske kulbrinter med lav molekylvægt (LMWAH'er), såsom naphthalen og dets derivater [methylnaphthalen, naphthoesyre, naphthalensulfonat og 1-naphthyl-N-methylcarbamat (carbaryl)], er blevet opført på listen over prioriterede organiske forurenende stoffer af det amerikanske miljøbeskyttelsesagentur (Environmental Protection Agency) som genotoksiske, mutagene og/eller kræftfremkaldende (Cerniglia, 1984). Frigivelse af denne klasse af NM-PAH'er i miljøet kan resultere i bioakkumulering af disse forbindelser på alle niveauer i fødekæden og derved påvirke økosystemernes sundhed (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Kilderne til og transportvejene for PAH'er til biota sker primært gennem migration og interaktioner mellem forskellige økosystemkomponenter såsom jord, grundvand, overfladevand, afgrøder og atmosfæren (Arey og Atkinson, 2003). Figur 1 viser interaktionerne og fordelingen af ​​forskellige lavmolekylære PAH'er i økosystemer og deres transportveje til biota/menneskelig eksponering. PAH'er aflejres på overflader som følge af luftforurening og gennem migration (drift) af køretøjsemissioner, industrielle udstødningsgasser (kulforgasning, forbrænding og koksproduktion) og deres aflejring. Industrielle aktiviteter såsom fremstilling af syntetiske tekstiler, farvestoffer og maling; træbeskyttelse; gummiforarbejdning; cementproduktion; pesticidproduktion; og landbrugsmæssige anvendelser er væsentlige kilder til PAH'er i terrestriske og akvatiske systemer (Bamforth og Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studier har vist, at jord i forstads- og byområder, nær motorveje og i store byer er mere modtagelige for polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) på grund af emissioner fra kraftværker, boligopvarmning, luft- og vejtrafikbelastninger samt bygge- og anlægsaktiviteter (Suman et al., 2016). (2008) viste, at PAH'er i jord nær veje i New Orleans, Louisiana, USA var så høje som 7189 μg/kg, hvorimod de i åbne områder kun var 2404 μg/kg. Tilsvarende er der rapporteret PAH-niveauer på helt op til 300 μg/kg i områder nær kulforgasningssteder i flere amerikanske byer (Kanaly og Harayama, 2000; Bamforth og Singleton, 2005). Jord fra forskellige indiske byer som Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni og Venkataraman, 2000) og Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) er blevet rapporteret at indeholde høje koncentrationer af PAH'er. Aromatiske forbindelser adsorberes lettere til jordpartikler, organisk materiale og lermineraler og bliver dermed vigtige kulstofdræn i økosystemer (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). De vigtigste kilder til PAH'er i akvatiske økosystemer er nedbør (våd/tør nedbør og vanddamp), byafstrømning, spildevandsudledning, grundvandsgenopladning osv. (Srogi, 2007). Det anslås, at omkring 80 % af PAH'erne i marine økosystemer stammer fra nedbør, sedimentation og affaldsudledning (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Højere koncentrationer af PAH'er i overfladevand eller perkolat fra deponeringsanlæg for fast affald lækker i sidste ende ud i grundvandet, hvilket udgør en alvorlig trussel mod folkesundheden, da mere end 70 % af befolkningen i Syd- og Sydøstasien drikker grundvand (Duttagupta et al., 2019). En nylig undersøgelse foretaget af Duttagupta et al. (2020) af flod- (32) og grundvandsanalyser (235) fra Vestbengalen, Indien, viste, at anslået 53 % af byboerne og 44 % af landbeboerne (i alt 20 millioner indbyggere) kan være udsat for naftalen (4,9-10,6 μg/L) og dets derivater. Forskellige arealanvendelsesmønstre og øget grundvandsudvinding anses for at være de vigtigste faktorer, der kontrollerer den vertikale transport (advektion) af lavmolekylære PAH'er i undergrunden. Landbrugsafstrømning, udledning af kommunalt og industrielt spildevand samt udledning af fast affald/skrald har vist sig at være påvirket af PAH'er i flodbækkener og sedimenter i undergrunden. Atmosfærisk nedbør forværrer yderligere PAH-forureningen. Høje koncentrationer af PAH'er og deres alkylderivater (51 i alt) er blevet rapporteret i floder/vandskel verden over, såsom Fraser River, Louan River, Denso River, Missouri River, Anacostia River, Ebro River og Delaware River (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). I sedimenterne i Ganges-flodbassinet blev naftalen og phenanthren fundet at være de mest betydningsfulde (detekteret i 70% af prøverne) (Duttagupta et al., 2019). Desuden har undersøgelser vist, at klorering af drikkevand kan føre til dannelse af mere giftige iltede og klorerede PAH'er (Manoli og Samara, 1999). PAH'er ophobes i korn, frugt og grøntsager som følge af planters optagelse fra forurenet jord, grundvand og nedbør (Fismes et al., 2002). Mange vandlevende organismer såsom fisk, muslinger, hjertemuslinger og rejer er forurenet med PAH'er gennem indtagelse af forurenet mad og havvand, samt gennem væv og hud (Mackay og Fraser, 2000). Tilberednings-/forarbejdningsmetoder såsom grillning, ristning, rygning, stegning, tørring, bagning og tilberedning med trækul kan også føre til betydelige mængder PAH'er i fødevarer. Dette afhænger i høj grad af valget af rygemateriale, indholdet af fenoliske/aromatiske kulbrinter, tilberedningsprocedure, varmelegemetype, fugtighedsindhold, ilttilførsel og forbrændingstemperatur (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) er også blevet påvist i mælk i varierende koncentrationer (0,75-2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Akkumuleringen af ​​disse PAH'er i fødevarer afhænger også af fødevarernes fysisk-kemiske egenskaber, mens deres toksiske virkninger er relateret til fysiologiske funktioner, metabolisk aktivitet, absorption, distribution og kropsdistribution (Mechini et al., 2011).
Toksiciteten og de skadelige virkninger af polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) har været kendt i lang tid (Cherniglia, 1984). Polycykliske aromatiske kulbrinter med lav molekylvægt (LMW-PAH'er) (to til tre ringe) kan binde kovalent til forskellige makromolekyler såsom DNA, RNA og proteiner og er kræftfremkaldende (Santarelli et al., 2008). På grund af deres hydrofobe natur er de adskilt af lipidmembraner. Hos mennesker oxiderer cytochrom P450 monooxygenaser PAH'er til epoxider, hvoraf nogle er meget reaktive (f.eks. baediolepoxid) og kan føre til transformation af normale celler til maligne celler (Marston et al., 2001). Derudover er transformationsprodukterne af PAH'er, såsom quinoner, phenoler, epoxider, dioler osv., mere giftige end de oprindelige forbindelser. Nogle PAH'er og deres metaboliske mellemprodukter kan påvirke hormoner og forskellige enzymer i stofskiftet og derved have en negativ indvirkning på vækst, centralnervesystemet, reproduktions- og immunsystemet (Swetha og Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Kortvarig eksponering for PAH'er med lav molekylvægt er blevet rapporteret at forårsage nedsat lungefunktion og trombose hos astmatikere og øge risikoen for hud-, lunge-, blære- og mave-tarmkræft (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Dyreforsøg har også vist, at PAH-eksponering kan have negative virkninger på reproduktionsfunktion og udvikling og kan forårsage grå stær, nyre- og leverskader samt gulsot. Forskellige PAH-biotransformationsprodukter såsom dioler, epoxider, quinoner og frie radikaler (kationer) har vist sig at danne DNA-addukter. Stabile addukter har vist sig at ændre DNA-replikationsmaskineriet, hvorimod ustabile addukter kan depurinere DNA (primært til adenin og undertiden til guanin); begge kan generere fejl, der fører til mutationer (Schweigert et al. 2001). Derudover kan quinoner (benzo-/pan-) generere reaktive iltarter (ROS), hvilket forårsager dødelig skade på DNA og andre makromolekyler og derved påvirker vævsfunktion/levedygtighed (Ewa og Danuta 2017). Kronisk eksponering for lave koncentrationer af pyren, biphenyl og naphthalen er blevet rapporteret at forårsage kræft hos forsøgsdyr (Diggs et al. 2012). På grund af deres dødelige toksicitet er oprydning/fjernelse af disse PAH'er fra berørte/forurenede steder en prioritet.
Forskellige fysiske og kemiske metoder er blevet anvendt til at fjerne PAH'er fra forurenede steder/miljøer. Processer som forbrænding, deklorering, UV-oxidation, fiksering og solventekstraktion har mange ulemper, herunder dannelse af giftige biprodukter, proceskompleksitet, sikkerheds- og reguleringsproblemer, lav effektivitet og høje omkostninger. Mikrobiel bionedbrydning (kaldet bioremediering) er imidlertid en lovende alternativ tilgang, der involverer brugen af ​​mikroorganismer i form af renkulturer eller kolonier. Sammenlignet med fysiske og kemiske metoder er denne proces miljøvenlig, ikke-invasiv, omkostningseffektiv og bæredygtig. Bioremediering kan udføres på det berørte sted (in situ) eller på et specielt forberedt sted (ex situ) og betragtes derfor som en mere bæredygtig afhjælpningsmetode end traditionelle fysiske og kemiske metoder (Juhasz og Naidu, 2000; Andreoni og Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Forståelse af de mikrobielle metaboliske trin involveret i nedbrydningen af ​​aromatiske forurenende stoffer har enorme videnskabelige og økonomiske implikationer for økologisk og miljømæssig bæredygtighed. Det anslås, at 2,1×1018 gram kulstof (C) lagres i sedimenter og organiske forbindelser (dvs. olie, naturgas og kul, dvs. fossile brændstoffer) på verdensplan, hvilket yder et betydeligt bidrag til den globale kulstofcyklus. Imidlertid udtømmer hurtig industrialisering, udvinding af fossile brændstoffer og menneskelige aktiviteter disse lithosfæriske kulstofreservoirer og frigiver anslået 5,5×1015 g organisk kulstof (som forurenende stoffer) i atmosfæren årligt (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Det meste af dette organiske kulstof kommer ind i terrestriske og marine økosystemer gennem sedimentation, transport og afstrømning. Derudover forurener nye syntetiske forurenende stoffer, der stammer fra fossile brændstoffer, såsom plast, blødgørere og plaststabilisatorer (phthalater og deres isomerer), alvorligt marine, jordbunds- og akvatiske økosystemer og deres biota, hvilket forværrer de globale klimarisici. Forskellige typer mikroplast, nanoplast, plastfragmenter og deres giftige monomerprodukter afledt af polyethylenterephthalat (PET) har ophobet sig i Stillehavet mellem Nordamerika og Sydøstasien og dannet "den store affaldsplet i Stillehavet", der skader havlivet (Newell et al., 2020). Videnskabelige undersøgelser har vist, at det ikke er muligt at fjerne sådanne forurenende stoffer/affald ved hjælp af fysiske eller kemiske metoder. I denne sammenhæng er de mest nyttige mikroorganismer dem, der er i stand til oxidativt at metabolisere forurenende stoffer til kuldioxid, kemisk energi og andre ikke-giftige biprodukter, der til sidst indgår i andre næringsstofcyklusprocesser (H2, O2, N2, S2, P2, Fe2 osv.). Derfor er forståelsen af ​​den mikrobielle økofysiologi ved mineralisering af aromatiske forurenende stoffer og dens miljøkontrol afgørende for at vurdere den mikrobielle kulstofcyklus, nettokulstofbudgettet og fremtidige klimarisici. I betragtning af det presserende behov for at fjerne sådanne forbindelser fra miljøet er der opstået forskellige økoindustrier med fokus på rene teknologier. Alternativt betragtes værdiansættelse af industriaffald/affaldskemikalier, der akkumuleres i økosystemer (dvs. "waste to wealth"-tilgangen), som en af ​​grundpillerne i den cirkulære økonomi og bæredygtige udviklingsmål (Close et al., 2012). Derfor er det af største betydning at forstå de metaboliske, enzymatiske og genetiske aspekter af disse potentielle nedbrydningskandidater for effektiv fjernelse og bioremediering af sådanne aromatiske forurenende stoffer.
Blandt de mange aromatiske forurenende stoffer lægger vi særlig vægt på lavmolekylære PAH'er såsom naftalen og substituerede naftalener. Disse forbindelser er hovedkomponenter i olieafledte brændstoffer, tekstilfarvestoffer, forbrugerprodukter, pesticider (mølkugler og insektmidler), blødgørere og tanniner og er derfor udbredte i mange økosystemer (Preuss et al., 2003). Nylige rapporter fremhæver akkumuleringen af ​​naftalenkoncentrationer i grundvandssedimenter, grundvand og underjordiske jordtyper, vadosezoner og flodlejer, hvilket tyder på dets bioakkumulering i miljøet (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabel 2 opsummerer de fysisk-kemiske egenskaber, anvendelser og sundhedseffekter af naftalen og dets derivater. Sammenlignet med andre PAH'er med høj molekylvægt er naftalen og dets derivater mindre hydrofobe, mere vandopløselige og vidt udbredte i økosystemer, så de bruges ofte som modelsubstrater til at studere PAH'ers metabolisme, genetik og metaboliske diversitet. Et stort antal mikroorganismer er i stand til at metabolisere naftalen og dets derivater, og der findes omfattende information om deres metaboliske veje, enzymer og regulatoriske egenskaber (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Derudover er naftalen og dets derivater udpeget som prototypeforbindelser til vurdering af miljøforurening på grund af deres høje forekomst og biotilgængelighed. Det amerikanske miljøbeskyttelsesagentur (EPA) anslår, at de gennemsnitlige niveauer af naftalen er 5,19 μg pr. kubikmeter fra cigaretrøg, primært fra ufuldstændig forbrænding, og 7,8 til 46 μg fra sidestrømsrøg, mens eksponering for kreosot og naftalen er 100 til 10.000 gange højere (Preuss et al. 2003). Især naftalen har vist sig at have arts-, regions- og kønsspecifik respiratorisk toksicitet og kræftfremkaldende egenskaber. Baseret på dyreforsøg har Det Internationale Agentur for Kræftforskning (IARC) klassificeret naftalen som et "muligt kræftfremkaldende stof for mennesker" (gruppe 2B)1. Eksponering for substituerede naphthalener, primært ved inhalation eller parenteral (oral) administration, forårsager lungevævsskade og øger forekomsten af ​​lungetumorer hos rotter og mus (National Toxicology Program 2). Akutte virkninger omfatter kvalme, opkastning, mavesmerter, diarré, hovedpine, forvirring, kraftig svedtendens, feber, takykardi osv. På den anden side er det bredspektrede carbamatinsekticid carbaryl (1-naphthyl N-methylcarbamat) blevet rapporteret at være giftigt for vandlevende hvirvelløse dyr, padder, honningbier og mennesker, og det har vist sig at hæmme acetylcholinesterase, hvilket forårsager lammelse (Smulders et al., 2003; Bulen og Distel, 2011). Derfor er forståelse af mekanismerne bag mikrobiel nedbrydning, genetisk regulering, enzymatiske og cellulære reaktioner afgørende for at udvikle bioremedieringsstrategier i forurenede miljøer.
Tabel 2. Detaljeret information om de fysisk-kemiske egenskaber, anvendelser, identifikationsmetoder og tilhørende sygdomme ved naftalen og dets derivater.
I forurenede nicher kan hydrofobe og lipofile aromatiske forurenende stoffer forårsage en række cellulære effekter på det miljømæssige mikrobiom (samfund), såsom ændringer i membranfluiditet, membranpermeabilitet, hævelse af lipiddobbeltlaget, forstyrrelse af energioverførsel (elektrontransportkæde/protonmotorkraft) og aktivitet af membranassocierede proteiner (Sikkema et al., 1995). Derudover genererer nogle opløselige mellemprodukter såsom katekoler og quinoner reaktive iltarter (ROS) og danner addukter med DNA og proteiner (Penning et al., 1999). Således udøver forekomsten af ​​​​sådanne forbindelser i økosystemer et selektivt pres på mikrobielle samfund for at blive effektive nedbrydere på forskellige fysiologiske niveauer, herunder optagelse/transport, intracellulær transformation, assimilering/udnyttelse og kompartmentalisering.
En søgning i Ribosomal Database Project-II (RDP-II) afslørede, at i alt 926 bakteriearter blev isoleret fra medier eller berigelseskulturer kontamineret med naftalen eller dets derivater. Proteobacteria-gruppen havde det højeste antal repræsentanter (n = 755), efterfulgt af Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) og uklassificerede bakterier (8) (Figur 2). Repræsentanter for γ-Proteobacteria (Pseudomonadales og Xanthomonadales) dominerede alle gramnegative grupper med højt G+C-indhold (54%), mens Clostridiales og Bacillales (30%) var grampositive grupper med lavt G+C-indhold. Pseudomonas (det højeste antal, 338 arter) blev rapporteret at være i stand til at nedbryde naftalen og dets methylderivater i forskellige forurenede økosystemer (stenkulstjære, olie, råolie, slam, olieudslip, spildevand, organisk affald og lossepladser) samt i intakte økosystemer (jord, floder, sedimenter og grundvand) (Figur 2). Desuden afslørede berigelsesstudier og metagenomisk analyse af nogle af disse regioner, at udyrkede Legionella- og Clostridium-arter kan have nedbrydningskapacitet, hvilket indikerer behovet for at dyrke disse bakterier for at studere nye pathways og metabolisk diversitet.
Fig. 2. Taksonomisk diversitet og økologisk fordeling af bakterielle repræsentanter i miljøer forurenet med naftalen og naftalenderivater.
Blandt de forskellige aromatiske kulbrinte-nedbrydende mikroorganismer er de fleste i stand til at nedbryde naftalen som den eneste kilde til kulstof og energi. Rækkefølgen af ​​begivenheder involveret i naftalenmetabolisme er blevet beskrevet for Pseudomonas sp. (stammer: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 og CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 og andre stammer (ND6 og AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis og Zylstra, 2004; Sota et al., 2006); Metabolismen initieres af en multikomponent dioxygenase [naphthalen dioxygenase (NDO), en ringhydroxylerende dioxygenase], der katalyserer oxidationen af ​​en af ​​de aromatiske ringe i naphthalen ved hjælp af molekylært ilt som det andet substrat, hvorved naphthalen omdannes til cis-naphthalenediol (Figur 3). Cis-dihydrodiol omdannes til 1,2-dihydroxynaphthalen ved hjælp af en dehydrogenase. En ringspaltende dioxygenase, 1,2-dihydroxynaphthalen dioxygenase (12DHNDO), omdanner 1,2-dihydroxynaphthalen til 2-hydroxychromen-2-carboxylsyre. Enzymatisk cis-trans-isomerisering producerer trans-o-hydroxybenzylidenpyruvat, som spaltes af hydratase-aldolase til salicylaldehyd og pyruvat. Den organiske syre pyruvat var den første C3-forbindelse, der blev afledt af naftalen-kulstofskelettet og dirigeret ind i den centrale kulstofvej. Derudover omdanner NAD+-afhængig salicylaldehyddehydrogenase salicylaldehyd til salicylsyre. Metabolisme på dette stadie kaldes den "øvre vej" for naftalen-nedbrydning. Denne vej er meget almindelig i de fleste naftalen-nedbrydende bakterier. Der er dog et par undtagelser; for eksempel initieres naftalen-nedbrydningen i den termofile Bacillus hamburgii 2 af naftalen-2,3-dioxygenase til danner 2,3-dihydroxynaphthalen (Annweiler et al., 2000).
Figur 3. Nedbrydningsveje for naftalen, methylnaphthalen, naphthoesyre og carbaryl. De omringede tal repræsenterer enzymer, der er ansvarlige for den sekventielle omdannelse af naftalen og dets derivater til efterfølgende produkter. 1 — naftalendioxygenase (NDO); 2, cis-dihydrodioldehydrogenase; 3, 1,2-dihydroxynaphthalendioxygenase; 4, 2-hydroxychromen-2-carboxylsyreisomerase; 5, trans-O-hydroxybenzylidenpyruvathydratase-aldolase; 6, salicylaldehyddehydrogenase; 7, salicylat-1-hydroxylase; 8, catechol-2,3-dioxygenase (C23DO); 9, 2-hydroxymuconatsemialdehyddehydrogenase; 10, 2-oxopent-4-enoathydratase; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoat-aldolase; 12, acetaldehyddehydrogenase; 13, catechol-1,2-dioxygenase (C12DO); 14, muconatcycloisomerase; 15, muconolacton delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenollactonhydrolase; 17, β-ketoadipat succinyl-CoA transferase; 18, β-ketoadipat-CoA thiolase; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA succinyltransferase; 20, salicylat 5-hydroxylase; 21-gentisat 1,2-dioxygenase (GDO); 22, maleylpyruvatisomerase; 23, fumarylpyruvathydrolase; 24, methylnaphthalenhydroxylase (NDO); 25, hydroxymethylnaphthalendehydrogenase; 26, naphthaldehyddehydrogenase; 27, 3-formylsalicylsyreoxidase; 28, hydroxyisophthalatdecarboxylase; 29, carbarylhydrolase (CH); 30, 1-naphthol-2-hydroxylase.
Afhængigt af organismen og dens genetiske sammensætning metaboliseres den resulterende salicylsyre yderligere enten via catechol-signalvejen ved hjælp af salicylat 1-hydroxylase (S1H) eller via gentisat-signalvejen ved hjælp af salicylat 5-hydroxylase (S5H) (Figur 3). Da salicylsyre er det vigtigste mellemprodukt i naphthalenmetabolismen (øvre signalvej), kaldes trinnene fra salicylsyre til TCA-mellemproduktet ofte for den nedre signalvej, og generne er organiseret i en enkelt operon. Det er almindeligt at se, at generne i den øvre signalvejsoperon (nah) og den nedre signalvejsoperon (sal) reguleres af fælles regulatoriske faktorer; for eksempel fungerer NahR og salicylsyre som induktorer, hvilket tillader begge operoner at metabolisere naphthalen fuldstændigt (Phale et al., 2019, 2020).
Derudover spaltes catechol cyklisk til 2-hydroxymuconatsemialdehyd via meta-signalvejen af ​​catechol 2,3-dioxygenase (C23DO) (Yen et al., 1988) og hydrolyseres yderligere af 2-hydroxymuconatsemialdehydhydrolase for at danne 2-hydroxypent-2,4-diensyre. 2-hydroxypent-2,4-dienoat omdannes derefter til pyruvat og acetaldehyd af en hydratase (2-oxopent-4-enoathydratase) og en aldolase (4-hydroxy-2-oxopentanoat-aldolase) og går derefter ind i den centrale kulstofvej (Figur 3). Alternativt spaltes catechol cyklisk til cis,cis-muconat via ortho-signalvejen af ​​catechol 1,2-oxygenase (C12DO). Muconat-cycloisomerase, muconolactonisomerase og β-ketoadipat-nollactonhydrolase omdanner cis,cis-muconat til 3-oxoadipat, som kommer ind i den centrale kulstofvej via succinyl-CoA og acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figur 3).
I gentisat (2,5-dihydroxybenzoat)-signalvejen spaltes den aromatiske ring af gentisat 1,2-dioxygenase (GDO) for at danne maleylpyruvat. Dette produkt kan hydrolyseres direkte til pyruvat og malat, eller det kan isomeriseres for at danne fumarylpyruvat, som derefter kan hydrolyseres til pyruvat og fumarat (Larkin og Day, 1986). Valget af den alternative signalvej er blevet observeret i både gramnegative og grampositive bakterier på biokemisk og genetisk niveau (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegative bakterier (Pseudomonas) foretrækker at bruge salicylsyre, som er en induktor af naftalenmetabolisme, og decarboxylerer den til catechol ved hjælp af salicylat 1-hydroxylase (Gibson og Subramanian, 1984). På den anden side omdanner salicylat 5-hydroxylase salicylsyre til gentisinsyre i grampositive bakterier (Rhodococcus), hvorimod salicylsyre ikke har nogen induktiv effekt på transkriptionen af ​​naphthalen-gener (Grund et al., 1992) (Figur 3).
Det er blevet rapporteret, at arter som Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas og Mycobacterium-arter kan nedbryde monomethylnaphthalen eller dimethylnaphthalen (Dean-Raymond og Bartha, 1975; Cane og Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Blandt dem er 1-methylnaphthalen og 2-methylnaphthalen nedbrydningsvejene for Pseudomonas sp. CSV86 blevet tydeligt undersøgt på biokemisk og enzymatisk niveau (Mahajan et al., 1994). 1-methylnaphthalen metaboliseres via to veje. Først hydroxyleres den aromatiske ring (den usubstituerede ring af methylnaphthalen) for at danne cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaphthalen, som yderligere oxideres til methylsalicylat og methylcatechol, og derefter går ind i den centrale kulstofvej efter ringspaltning (Figur 3). Denne vej kaldes "kulstofkildevejen". I den anden "afgiftningsvej" kan methylgruppen hydroxyleres af NDO for at danne 1-hydroxymethylnaphthalen, som yderligere oxideres til 1-nafthoesyre og udskilles i dyrkningsmediet som et blindgydeprodukt. Undersøgelser har vist, at stammen CSV86 ikke er i stand til at vokse på 1- og 2-nafthoesyre som eneste kulstof- og energikilde, hvilket bekræfter dens afgiftningsvej (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). I 2-methylnaphthalen undergår methylgruppen hydroxylering af hydroxylase for at danne 2-hydroxymethylnaphthalen. Derudover undergår den usubstituerede ring i naphthalenringen ringhydroxylering for at danne en dihydrodiol, som oxideres til 4-hydroxymethylcatechol i en række enzymkatalyserede reaktioner og går ind i den centrale kulstofvej via meta-ringspaltningsvejen. Tilsvarende blev det rapporteret, at S. paucimobilis 2322 anvender NDO til at hydroxylere 2-methylnaphthalen, som yderligere oxideres for at danne methylsalicylat og methylcatechol (Dutta et al., 1998).
Nafthoesyrer (substituerede/usubstituerede) er biprodukter fra afgiftning/biotransformation, der dannes under nedbrydningen af ​​methylnaphthalen, phenanthren og anthracen og frigives til det brugte dyrkningsmedium. Det er blevet rapporteret, at jordisolatet Stenotrophomonas maltophilia CSV89 er i stand til at metabolisere 1-naphthoesyre som en kulstofkilde (Phale et al., 1995). Metabolismen begynder med dihydroxylering af den aromatiske ring for at danne 1,2-dihydroxy-8-carboxynaphthalen. Den resulterende diol oxideres til catechol via 2-hydroxy-3-carboxybenzylidenpyruvat, 3-formylsalicylsyre, 2-hydroxyisophthalsyre og salicylsyre og går ind i den centrale kulstofvej via meta-ring-spaltningsvejen (Figur 3).
Carbaryl er et pesticid af naphthylcarbamat. Siden den grønne revolution i Indien i 1970'erne har brugen af ​​kunstgødning og pesticider ført til en stigning i emissioner af polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH) fra landbrugsmæssige ikke-punktkilder (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Det anslås, at 55 % (85.722.000 hektar) af det samlede dyrkede areal i Indien behandles med kemiske pesticider. I løbet af de sidste fem år (2015-2020) har den indiske landbrugssektor brugt et gennemsnit på 55.000 til 60.000 tons pesticider årligt (Department of Cooperatives and Farmers Welfare, Ministry of Agriculture, Government of India, august 2020). I de nordlige og centrale Ganges-sletter (staterne med den højeste befolkning og befolkningstæthed) er brugen af ​​pesticider på afgrøder udbredt, med insekticider som den dominerende faktor. Carbaryl (1-naphthyl-N-methylcarbamat) er et bredspektret, moderat til meget giftigt carbamatinsekticid, der anvendes i indisk landbrug i en gennemsnitlig mængde på 100-110 tons. Det sælges almindeligvis under handelsnavnet Sevin og bruges til at bekæmpe insekter (bladlus, ildmyrer, lopper, mider, edderkopper og mange andre udendørs skadedyr), der påvirker en række forskellige afgrøder (majs, sojabønner, bomuld, frugt og grøntsager). Nogle mikroorganismer såsom Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus og Arthrobacter kan også bruges til at bekæmpe andre skadedyr. Det er blevet rapporteret, at RC100 kan nedbryde carbaryl (Larkin og Day, 1986; Chapalamadugu og Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha og Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Nedbrydningsvejen for carbaryl er blevet grundigt undersøgt på biokemiske, enzymatiske og genetiske niveauer i jordisolater af Pseudomonas sp. Stammerne C4, C5 og C6 (Swetha og Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (fig. 3). Metabolismen starter med hydrolysen af ​​esterbindingen ved hjælp af carbarylhydrolase (CH4) for at danne 1-naphthol, methylamin og kuldioxid. 1-naphthol omdannes derefter til 1,2-dihydroxynaphthalen af ​​1-naphtholhydroxylase (1-NH), som yderligere metaboliseres via den centrale kulstofvej via salicylat og gentisat. Nogle carbaryl-nedbrydende bakterier har vist sig at metabolisere det til salicylsyre via spaltning af catechol-ortho-ringen (Larkin og Day, 1986; Chapalamadugu og Chaudhry, 1991). Det er værd at bemærke, at naftalen-nedbrydende bakterier primært metaboliserer salicylsyre via catechol, hvorimod carbaryl-nedbrydende bakterier foretrækker at metabolisere salicylsyre via gentisatvejen.
Naphthalensulfonsyre/disulfonsyre og naphthylaminsulfonsyrederivater kan anvendes som mellemprodukter i produktionen af ​​azofarvestoffer, befugtningsmidler, dispergeringsmidler osv. Selvom disse forbindelser har lav toksicitet for mennesker, har cytotoksicitetsvurderinger vist, at de er dødelige for fisk, dafnier og alger (Greim et al., 1994). Repræsentanter for slægten Pseudomonas (stammerne A3, C22) har vist sig at initiere metabolisme ved dobbelt hydroxylering af den aromatiske ring, der indeholder sulfonsyregruppen, for at danne en dihydrodiol, som yderligere omdannes til 1,2-dihydroxynaphthalen ved spontan spaltning af sulfitgruppen (Brilon et al., 1981). Den resulterende 1,2-dihydroxynaphthalen kataboliseres via den klassiske naftalin-vej, dvs. catechol- eller gentisat-vejen (Figur 4). Det er blevet vist, at aminonaphthalensulfonsyre og hydroxynaphthalensulfonsyre kan nedbrydes fuldstændigt af blandede bakteriekonsortier med komplementære kataboliske veje (Nortemann et al., 1986). Det er blevet vist, at et medlem af konsortiet afsvovler aminonaphthalensulfonsyre eller hydroxynaphthalensulfonsyre ved 1,2-dioxygenering, mens aminosalicylat eller hydroxysalacylat frigives til dyrkningsmediet som en blindgydemetabolit og efterfølgende optages af andre medlemmer af konsortiet. Naphthalendisulfonsyre er relativt polær, men dårligt bionedbrydelig og kan derfor metaboliseres via forskellige veje. Den første afsvovling sker under regioselektiv dihydroxylering af den aromatiske ring og sulfonsyregruppen; Den anden afsvovling sker under hydroxylering af 5-sulfosalicylsyre ved hjælp af salicylsyre-5-hydroxylase, hvilket danner gentisinsyre, som går ind i den centrale kulstofvej (Brilon et al., 1981) (Figur 4). De enzymer, der er ansvarlige for nedbrydning af naftalen, er også ansvarlige for metabolismen af ​​naftalensulfonat (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figur 4. Metaboliske veje for nedbrydning af naphthalensulfonat. Tallene i cirklerne repræsenterer de enzymer, der er ansvarlige for naphthylsulfonatmetabolisme, svarende til/identiske med de enzymer, der er beskrevet i FIG. 3.
Lavmolekylære PAH'er (LMW-PAH'er) er reducerbare, hydrofobe og dårligt opløselige og derfor ikke modtagelige for naturlig nedbrydning/nedbrydning. Aerobe mikroorganismer er dog i stand til at oxidere dem ved at absorbere molekylært ilt (O2). Disse enzymer tilhører hovedsageligt klassen af ​​oxidoreduktaser og kan udføre forskellige reaktioner såsom aromatisk ringhydroxylering (mono- eller dihydroxylering), dehydrogenering og aromatisk ringspaltning. Produkterne fra disse reaktioner er i en højere oxidationstilstand og metaboliseres lettere gennem den centrale kulstofvej (Phale et al., 2020). Enzymerne i nedbrydningsvejen er rapporteret at være inducerbare. Aktiviteten af ​​disse enzymer er meget lav eller ubetydelig, når celler dyrkes på simple kulstofkilder såsom glukose eller organiske syrer. Tabel 3 opsummerer de forskellige enzymer (oxygenaser, hydrolaser, dehydrogenaser, oxidaser osv.), der er involveret i metabolismen af ​​naftalen og dets derivater.
Tabel 3. Biokemiske egenskaber ved enzymer, der er ansvarlige for nedbrydningen af ​​naftalen og dets derivater.
Radioisotopstudier (18O2) har vist, at inkorporeringen af ​​molekylært O2 i aromatiske ringe af oxygenaser er det vigtigste trin i aktivering af yderligere bionedbrydning af en forbindelse (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Inkorporeringen af ​​et oxygenatom (O) fra molekylært oxygen (O2) i substratet initieres af enten endogene eller eksogene monooxygenaser (også kaldet hydroxylaser). Et andet oxygenatom reduceres til vand. Eksogene monooxygenaser reducerer flavin med NADH eller NADPH, hvorimod flavin i endomonooxygenaser reduceres af substratet. Hydroxyleringspositionen resulterer i diversitet i produktdannelsen. For eksempel hydroxylerer salicylat 1-hydroxylase salicylsyre i C1-positionen og danner catechol. På den anden side hydroxylerer multikomponentsalicylat 5-hydroxylase (indeholdende reduktase-, ferredoxin- og oxygenase-underenheder) salicylsyre i C5-positionen og danner gentisinsyre (Yamamoto et al., 1965).
Dioxygenaser inkorporerer to O2-atomer i substratet. Afhængigt af de dannede produkter opdeles de i ringhydroxylerende dioxygenaser og ringspaltende dioxygenaser. Ringhydroxylerende dioxygenaser omdanner aromatiske substrater til cis-dihydrodioler (f.eks. naphthalen) og er udbredte blandt bakterier. Til dato er det blevet vist, at organismer, der indeholder ringhydroxylerende dioxygenaser, er i stand til at vokse på forskellige aromatiske kulstofkilder, og disse enzymer klassificeres som NDO (naphthalen), toluendioxygenase (TDO, toluen) og biphenyldioxygenase (BPDO, biphenyl). Både NDO og BPDO kan katalysere dobbeltoxidation og sidekædehydroxylering af forskellige polycykliske aromatiske kulbrinter (toluen, nitrotoluen, xylen, ethylbenzen, naphthalen, biphenyl, fluoren, indol, methylnaphthalen, naphthalensulfonat, phenanthren, anthracen, acetophenon osv.) (Boyd og Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO er et multikomponentsystem bestående af en oxidoreduktase, et ferredoxin og en aktiv oxygenasekomponent (Gibson og Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Den katalytiske enhed i NDO består af en stor α-underenhed og en lille β-underenhed arrangeret i en α3β3-konfiguration. NDO tilhører en stor familie af oxygenaser, og dens α-underenhed indeholder et Rieske-sted [2Fe-2S] og et mononukleært ikke-hæmjern, som bestemmer substratspecificiteten af ​​NDO (Parales et al., 1998). Typisk overføres to elektroner fra reduktionen af ​​pyridinnukleotid i en katalytisk cyklus til Fe(II)-ionen i det aktive sted via en reduktase, et ferredoxin og et Rieske-sted. De reducerende ækvivalenter aktiverer molekylært ilt, hvilket er en forudsætning for substratdihydroxylering (Ferraro et al., 2005). Til dato er kun få NDO'er blevet oprenset og karakteriseret i detaljer fra forskellige stammer, og den genetiske kontrol af de veje, der er involveret i naftalennedbrydning, er blevet undersøgt i detaljer (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ringspaltende dioxygenaser (endo- eller ortho-ringspaltende enzymer og exodiol- eller meta-ringspaltende enzymer) virker på hydroxylerede aromatiske forbindelser. For eksempel er den ortho-ringspaltende dioxygenase catechol-1,2-dioxygenase, hvorimod den meta-ringspaltende dioxygenase er catechol-2,3-dioxygenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Ud over forskellige oxygenaser er der også forskellige dehydrogenaser, der er ansvarlige for dehydrogeneringen af ​​aromatiske dihydrodioler, alkoholer og aldehyder, og som bruger NAD+/NADP+ som elektronacceptorer, hvilket er nogle af de vigtige enzymer involveret i metabolismen (Gibson og Subramanian, 1984; Shaw og Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzymer såsom hydrolaser (esteraser, amidaser) er en anden vigtig klasse af enzymer, der bruger vand til at spalte kovalente bindinger og udviser bred substratspecificitet. Carbarylhydrolase og andre hydrolaser betragtes som komponenter i periplasmaet (transmembranen) i medlemmer af gramnegative bakterier (Kamini et al., 2018). Carbaryl har både en amid- og en esterbinding; derfor kan det hydrolyseres af enten esterase eller amidase for at danne 1-naphthol. Carbaryl i Rhizobium rhizobium-stammen AC10023 og Arthrobacter-stammen RC100 er blevet rapporteret at fungere som henholdsvis en esterase og amidase. Carbaryl i Arthrobacter-stammen RC100 fungerer også som en amidase. RC100 har vist sig at hydrolysere fire insekticider af N-methylcarbamat-klassen, såsom carbaryl, methomyl, mefenaminsyre og XMC (Hayaatsu et al., 2001). Det blev rapporteret, at CH i Pseudomonas sp. C5pp kan virke på carbaryl (100% aktivitet) og 1-naphthylacetat (36% aktivitet), men ikke på 1-naphthylacetamid, hvilket indikerer, at det er en esterase (Trivedi et al., 2016).
Biokemiske undersøgelser, enzymreguleringsmønstre og genetisk analyse har vist, at naftalen-nedbrydningsgenerne består af to inducerbare regulatoriske enheder eller "operoner": nah ("opstrømsvejen", der omdanner naftalen til salicylsyre) og sal ("nedstrømsvejen", der omdanner salicylsyre til den centrale kulstofvej via catechol). Salicylsyre og dens analoger kan fungere som induktorer (Shamsuzzaman og Barnsley, 1974). I nærvær af glukose eller organiske syrer undertrykkes operonen. Figur 5 viser den komplette genetiske organisering af naftalen-nedbrydning (i operonform). Adskillige navngivne varianter/former af nah-genet (ndo/pah/dox) er blevet beskrevet og fundet at have høj sekvenshomologi (90%) blandt alle Pseudomonas-arter (Abbasian et al., 2016). Generne for naftalen-opstrømsvejen var generelt arrangeret i en konsensusorden som vist i figur 5A. Et andet gen, nahQ, blev også rapporteret at være involveret i naftalenmetabolisme og var normalt placeret mellem nahC og nahE, men dets faktiske funktion er endnu ikke klarlagt. Tilsvarende blev nahY-genet, der er ansvarligt for naftalen-følsom kemotaksi, fundet i den distale ende af nah-operonen hos nogle medlemmer. I Ralstonia sp. blev U2-genet, der koder for glutathion S-transferase (gsh), fundet at være placeret mellem nahAa og nahAb, men påvirkede ikke naftalenudnyttelsesegenskaberne (Zylstra et al., 1997).
Figur 5. Genetisk organisation og diversitet observeret under nedbrydning af naftalen blandt bakteriearter; (A) Øvre naftalenvej, metabolisme af naftalen til salicylsyre; (B) Nedre naftalenvej, salicylsyre via catechol til den centrale kulstofvej; (C) salicylsyre via gentisat til den centrale kulstofvej.
Den "nedre signalvej" (sal-operon) består typisk af nahGTHINLMOKJ og omdanner salicylat til pyruvat og acetaldehyd via catechol-metariseringsspaltningsvejen. nahG-genet (som koder for salicylathydroxylase) viste sig at være konserveret i den proximale ende af operonen (fig. 5B). Sammenlignet med andre naphthalen-nedbrydende stammer er nah- og sal-operonerne i P. putida CSV86 tandem og meget nært beslægtede (ca. 7,5 kb). I nogle gramnegative bakterier, såsom Ralstonia sp. U2, Polaramonas naphthalenivorans CJ2 og P. putida AK5, metaboliseres naphthalen som en central kulstofmetabolit via gentisatvejen (i form af sgp/nag-operonen). Genkassetten er typisk repræsenteret i formen nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, hvor nagR (som koder for en LysR-type regulator) er placeret i den øvre ende (figur 5C).
Carbaryl indgår i den centrale kulstofcyklus via metabolismen af ​​1-naphthol, 1,2-dihydroxynaphthalen, salicylsyre og gentisinsyre (Figur 3). Baseret på genetiske og metaboliske studier er det blevet foreslået at opdele denne metaboliske pathway i "opstrøms" (omdannelse af carbaryl til salicylsyre), "mellem" (omdannelse af salicylsyre til gentisinsyre) og "nedstrøms" (omdannelse af gentisinsyre til mellemprodukter i den centrale kulstofcyklus) (Singh et al., 2013). Genomisk analyse af C5pp (supercontig A, 76,3 kb) viste, at mcbACBDEF-genet er involveret i omdannelsen af ​​carbaryl til salicylsyre, efterfulgt af mcbIJKL i omdannelsen af ​​salicylsyre til gentisinsyre og mcbOQP i omdannelsen af ​​gentisinsyre til centrale kulstofmellemprodukter (fumarat og pyruvat, Trivedi et al., 2016) (Figur 6).
Det er blevet rapporteret, at enzymer involveret i nedbrydningen af ​​aromatiske kulbrinter (herunder naphthalen og salicylsyre) kan induceres af de tilsvarende forbindelser og hæmmes af simple kulstofkilder såsom glukose eller organiske syrer (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Blandt de forskellige metaboliske veje for naphthalen og dets derivater er de regulatoriske egenskaber ved naphthalen og carbaryl blevet undersøgt i et vist omfang. For naphthalen reguleres gener i både opstrøms- og nedstrømsvejene af NahR, en trans-aktiv positiv regulator af LysR-typen. Den er nødvendig for induktionen af ​​nah-genet af salicylsyre og dens efterfølgende højniveauekspression (Yen og Gunsalus, 1982). Desuden har undersøgelser vist, at integrativ værtsfaktor (IHF) og XylR (sigma 54-afhængig transkriptionsregulator) også er kritiske for den transkriptionelle aktivering af gener i naphthalenmetabolisme (Ramos et al., 1997). Studier har vist, at enzymer i catechol-meta-ringåbningsvejen, nemlig catechol 2,3-dioxygenase, induceres i nærvær af naftalen og/eller salicylsyre (Basu et al., 2006). Studier har vist, at enzymer i catechol-ortho-ringåbningsvejen, nemlig catechol 1,2-dioxygenase, induceres i nærvær af benzoesyre og cis,cis-muconat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
I stamme C5pp koder fem gener, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR og mcbS, for regulatorer, der tilhører LysR/TetR-familien af ​​transkriptionelle regulatorer, der er ansvarlige for at kontrollere carbarylnedbrydning. Det homologe gen mcbG viste sig at være tættest beslægtet med LysR-type regulatoren PhnS (58% aminosyreidentitet), der er involveret i phenanthrenmetabolisme i Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). McbH-genet viste sig at være involveret i den mellemliggende signalvej (omdannelse af salicylsyre til gentisinsyre) og tilhører LysR-type transkriptionelle regulator NagR/DntR/NahR i Pseudomonas og Burkholderia. Medlemmer af denne familie blev rapporteret at genkende salicylsyre som et specifikt effektormolekyle til induktion af nedbrydningsgener. På den anden side blev tre gener, mcbN, mcbR og mcbS, der tilhører transkriptionelle regulatorer af typen LysR og TetR, identificeret i downstream-signalvejen (gentisat-centrale kulstofsignalvejsmetabolitter).
Hos prokaryoter er horisontale genoverførselsprocesser (erhvervelse, udveksling eller overførsel) via plasmider, transposoner, profager, genomiske øer og integrative konjugative elementer (ICE) væsentlige årsager til plasticitet i bakterielle genomer, hvilket fører til gevinst eller tab af specifikke funktioner/egenskaber. Det giver bakterier mulighed for hurtigt at tilpasse sig forskellige miljøforhold, hvilket giver potentielle adaptive metaboliske fordele for værten, såsom nedbrydning af aromatiske forbindelser. Metaboliske ændringer opnås ofte gennem finjustering af nedbrydningsoperoner, deres reguleringsmekanismer og enzymspecificiteter, hvilket letter nedbrydningen af ​​en bredere vifte af aromatiske forbindelser (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Genkassetterne til naftalennedbrydning har vist sig at være placeret på en række mobile elementer såsom plasmider (konjugative og ikke-konjugative), transposoner, genomer, ICE'er og kombinationer af forskellige bakteriearter (Figur 5). I Pseudomonas G7 transkriberes nah- og sal-operonerne i plasmid NAH7 i samme orientering og er en del af et defekt transposon, der kræver transposase Tn4653 for mobilisering (Sota et al., 2006). I Pseudomonas-stammen NCIB9816-4 blev genet fundet på det konjugative plasmid pDTG1 som to operoner (ca. 15 kb fra hinanden), der blev transkriberet i modsatte retninger (Dennis og Zylstra, 2004). I Pseudomonas putida-stammen AK5 koder det ikke-konjugative plasmid pAK5 for det enzym, der er ansvarligt for naftalennedbrydning via gentisatvejen (Izmalkova et al., 2013). I Pseudomonas-stammen PMD-1 er nah-operonen placeret på kromosomet, hvorimod sal-operonen er placeret på det konjugative plasmid pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). I Pseudomonas stutzeri AN10 er alle naftalen-nedbrydningsgener (nah- og sal-operoner) imidlertid placeret på kromosomet og rekrutteres formodentlig gennem transposition, rekombination og omlejringshændelser (Bosch et al., 2000). I Pseudomonas sp. CSV86 er nah- og sal-operonerne placeret i genomet i form af ICE (ICECSV86). Strukturen er beskyttet af tRNAGly efterfulgt af direkte gentagelser, der indikerer rekombinations-/bindingssteder (attR og attL) og en faglignende integrase placeret i begge ender af tRNAGly, og dermed strukturelt lig ICEclc-elementet (ICEclcB13 i Pseudomonas knackmusii for chlorocatechol-nedbrydning). Det er blevet rapporteret, at gener på ICE kan overføres ved konjugering med en ekstremt lav overførselsfrekvens (10-8), hvorved nedbrydningsegenskaber overføres til modtageren (Basu og Phale, 2008; Phale et al., 2019).
De fleste af de gener, der er ansvarlige for carbarylnedbrydning, er placeret på plasmider. Arthrobacter sp. RC100 indeholder tre plasmider (pRC1, pRC2 og pRC300), hvoraf to konjugative plasmider, pRC1 og pRC2, koder for de enzymer, der omdanner carbaryl til gentisat. På den anden side er de enzymer, der er involveret i omdannelsen af ​​gentisat til de centrale kulstofmetabolitter, placeret på kromosomet (Hayaatsu et al., 1999). Bakterier af slægten Rhizobium. Stamme AC100, der anvendes til omdannelse af carbaryl til 1-naphthol, indeholder plasmid pAC200, som bærer cehA-genet, der koder for CH, som en del af Tnceh-transposonet omgivet af insertionselementlignende sekvenser (istA og istB) (Hashimoto et al., 2002). I Sphingomonas-stammen CF06 menes carbaryl-nedbrydningsgenet at være til stede i fem plasmider: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 og pCF05. DNA-homologien mellem disse plasmider er høj, hvilket indikerer eksistensen af ​​en genduplikeringshændelse (Feng et al., 1997). I en carbaryl-nedbrydende symbiont bestående af to Pseudomonas-arter indeholder stammen 50581 et konjugativt plasmid pCD1 (50 kb), der koder for mcd-carbarylhydrolasegenet, hvorimod det konjugative plasmid i stammen 50552 koder for et 1-naphthol-nedbrydende enzym (Chapalamadugu og Chaudhry, 1991). I Achromobacter-stammen WM111 er mcd-furadanhydrolasegenet placeret på et 100 kb plasmid (pPDL11). Dette gen har vist sig at være til stede på forskellige plasmider (100, 105, 115 eller 124 kb) i forskellige bakterier fra forskellige geografiske regioner (Parekh et al., 1995). I Pseudomonas sp. C5pp er alle gener, der er ansvarlige for carbarylnedbrydning, placeret i et genom, der strækker sig over 76,3 kb sekvens (Trivedi et al., 2016). Genomanalyse (6,15 Mb) afslørede tilstedeværelsen af ​​42 MGE'er og 36 GEI'er, hvoraf 17 MGE'er var placeret i supercontig A (76,3 kb) med et gennemsnitligt asymmetrisk G+C-indhold (54-60 mol%), hvilket tyder på mulige horisontale genoverførselsbegivenheder (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 udviser et lignende arrangement af carbarylnedbrydende gener, men disse gener er placeret på et plasmid (Zhu et al., 2019).
Ud over metabolisk effektivitet på biokemiske og genomiske niveauer udviser mikroorganismer også andre egenskaber eller reaktioner såsom kemotaksi, celleoverflademodifikationsegenskaber, opdeling i områder, præferentiel udnyttelse, produktion af biosurfaktanter osv., som hjælper dem med mere effektivt at metabolisere aromatiske forurenende stoffer i forurenede miljøer (figur 7).
Figur 7. Forskellige cellulære responsstrategier hos ideelle aromatiske kulbrinte-nedbrydende bakterier til effektiv bionedbrydning af fremmede forurenende forbindelser.
Kemotaktiske reaktioner anses for at være faktorer, der forstærker nedbrydningen af ​​organiske forurenende stoffer i heterogent forurenede økosystemer. (2002) viste, at kemotaksi af Pseudomonas sp. G7 til naftalen øgede hastigheden af ​​naftalennedbrydning i akvatiske systemer. Vildtypestammen G7 nedbrød naftalen meget hurtigere end en kemotaksi-deficient mutantstamme. NahY-proteinet (538 aminosyrer med membrantopologi) viste sig at være co-transkriberet med metacleavage-pathway-generne på NAH7-plasmidet, og ligesom kemotaksitransducere ser dette protein ud til at fungere som en kemoreceptor for naftalennedbrydning (Grimm og Harwood 1997). Et andet studie af Hansel et al. (2009) viste, at proteinet er kemotaktisk, men dets nedbrydningshastighed er høj. (2011) demonstrerede en kemotaktisk reaktion hos Pseudomonas (P. putida) på gasformig naphthalen, hvor gasfasediffusion resulterede i en stabil strøm af naphthalen til cellerne, hvilket kontrollerede cellernes kemotaktiske reaktion. Forskerne udnyttede denne kemotaktiske adfærd til at manipulere mikrober, der ville øge nedbrydningshastigheden. Undersøgelser har vist, at kemosensoriske veje også regulerer andre cellulære funktioner såsom celledeling, cellecyklusregulering og biofilmdannelse, og derved hjælper med at kontrollere nedbrydningshastigheden. Imidlertid hæmmes udnyttelsen af ​​denne egenskab (kemotaksi) til effektiv nedbrydning af flere flaskehalse. De største hindringer er: (a) forskellige paraloge receptorer genkender de samme forbindelser/ligander; (b) eksistensen af ​​alternative receptorer, dvs. energisk tropisme; (c) signifikante sekvensforskelle i de sensoriske domæner af den samme receptorfamilie; og (d) mangel på information om de vigtigste bakterielle sensorproteiner (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Nogle gange producerer den biologiske nedbrydning af aromatiske kulbrinter flere metabolitter/mellemprodukter, som kan være kemotaktiske for én gruppe bakterier, men frastødende for andre, hvilket yderligere komplicerer processen. For at identificere interaktionerne mellem ligander (aromatiske kulbrinter) og kemiske receptorer konstruerede vi hybride sensorproteiner (PcaY, McfR og NahY) ved at fusionere sensor- og signaldomænerne fra Pseudomonas putida og Escherichia coli, som er målrettet mod receptorerne for henholdsvis aromatiske syrer, TCA-mellemprodukter og naphthalen (Luu et al., 2019).
Under påvirkning af naftalen og andre polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH'er) undergår strukturen af ​​bakteriemembranen og mikroorganismernes integritet betydelige ændringer. Studier har vist, at naftalen forstyrrer acylkædens interaktion gennem hydrofobe interaktioner, hvorved membranens hævelse og fluiditet øges (Sikkema et al., 1995). For at modvirke denne skadelige effekt regulerer bakterier membranens fluiditet ved at ændre forholdet og fedtsyresammensætningen mellem iso/anteiso forgrenede fedtsyrer og isomerisere cis-umættede fedtsyrer til de tilsvarende trans-isomerer (Heipieper og de Bont, 1994). I Pseudomonas stutzeri dyrket på naftalenbehandling steg forholdet mellem mættede og umættede fedtsyrer fra 1,1 til 2,1, hvorimod dette forhold i Pseudomonas JS150 steg fra 7,5 til 12,0 (Mrozik et al., 2004). Når Achromobacter KAs 3-5-celler dyrkes på naftalen, udviste de celleaggregering omkring naftalenkrystaller og et fald i celleoverfladeladning (fra -22,5 til -2,5 mV) ledsaget af cytoplasmisk kondensation og vakuolisering, hvilket indikerer ændringer i cellestruktur og celleoverfladeegenskaber (Mohapatra et al., 2019). Selvom cellulære/overfladeændringer er direkte forbundet med bedre optagelse af aromatiske forurenende stoffer, er relevante biotekniske strategier ikke blevet grundigt optimeret. Manipulation af celleform er sjældent blevet brugt til at optimere biologiske processer (Volke og Nikel, 2018). Deletion af gener, der påvirker celledeling, forårsager ændringer i cellemorfologi. Deletion af gener, der påvirker celledeling, forårsager ændringer i cellemorfologi. I Bacillus subtilis har celleseptumproteinet SepF vist sig at være involveret i septumdannelse og er påkrævet for efterfølgende trin i celledelingen, men det er ikke et essentielt gen. Deletion af gener, der koder for peptidglykanhydrolaser i Bacillus subtilis, resulterede i celleforlængelse, øget specifik vækstrate og forbedret enzymproduktionskapacitet (Cui et al., 2018).
Kompartmentalisering af carbaryl-nedbrydningsvejen er blevet foreslået for at opnå effektiv nedbrydning af Pseudomonas-stammerne C5pp og C7 (Kamini et al., 2018). Det foreslås, at carbaryl transporteres ind i det periplasmatiske rum gennem den ydre membranseptum og/eller gennem diffunderbare poriner. CH₄ er et periplasmisk enzym, der katalyserer hydrolysen af ​​carbaryl til 1-naphthol, som er mere stabil, mere hydrofob og mere toksisk. CH₄ er lokaliseret i periplasmaet og har en lav affinitet for carbaryl, hvilket kontrollerer dannelsen af ​​1-naphthol, hvorved det forhindres i at ophobes i celler og reduceres i dets toksicitet for celler (Kamini et al., 2018). Den resulterende 1-naphthol transporteres ind i cytoplasmaet over den indre membran ved opdeling og/eller diffusion og hydroxyleres derefter til 1,2-dihydroxynaphthalen af ​​enzymet 1NH₃ med høj affinitet til videre metabolisme i den centrale kulstofvej.
Selvom mikroorganismer har de genetiske og metaboliske evner til at nedbryde xenobiotiske kulstofkilder, er den hierarkiske struktur i deres udnyttelse (dvs. foretrukken brug af simple frem for komplekse kulstofkilder) en væsentlig hindring for bionedbrydning. Tilstedeværelsen og udnyttelsen af ​​simple kulstofkilder nedregulerer gener, der koder for enzymer, der nedbryder komplekse/ikke-foretrukne kulstofkilder såsom PAH'er. Et velundersøgt eksempel er, at når glukose og laktose tilføres Escherichia coli, udnyttes glukose mere effektivt end laktose (Jacob og Monod, 1965). Det er rapporteret, at Pseudomonas nedbryder en række forskellige PAH'er og xenobiotiske forbindelser som kulstofkilder. Hierarkiet for udnyttelse af kulstofkilder i Pseudomonas er organiske syrer > glukose > aromatiske forbindelser (Hylemon og Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Der er dog en undtagelse. Interessant nok er Pseudomonas sp. CSV86 udviser en unik hierarkisk struktur, der fortrinsvis anvender aromatiske kulbrinter (benzoesyre, naftalen osv.) frem for glukose og ko-metaboliserer aromatiske kulbrinter med organiske syrer (Basu et al., 2006). I denne bakterie er generne for nedbrydning og transport af aromatiske kulbrinter ikke nedreguleret, selv i nærvær af en anden kulstofkilde såsom glukose eller organiske syrer. Ved dyrkning i glukose- og aromatiske kulbrintermedium blev det observeret, at generne for glukosetransport og metabolisme var nedreguleret, aromatiske kulbrinter blev anvendt i den første logaritmiske fase, og glukose blev anvendt i den anden logaritmiske fase (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). På den anden side påvirkede tilstedeværelsen af ​​organiske syrer ikke ekspressionen af ​​aromatisk kulbrintemetabolisme, så denne bakterie forventes at være en kandidatstamme til bionedbrydningsstudier (Phale et al., 2020).
Det er velkendt, at kulbrintebiotransformation kan forårsage oxidativ stress og opregulering af antioxidante enzymer i mikroorganismer. Ineffektiv naftalen-biologisk nedbrydning både i stationære faseceller og i nærvær af giftige forbindelser fører til dannelsen af ​​reaktive iltarter (ROS) (Kang et al. 2006). Da naftalen-nedbrydende enzymer indeholder jern-svovlklynger, vil jernet i hæm- og jern-svovlproteiner blive oxideret under oxidativ stress, hvilket fører til proteininaktivering. Ferredoxin-NADP+ reduktase (Fpr) medierer sammen med superoxiddismutase (SOD) den reversible redoxreaktion mellem NADP+/NADPH og to molekyler af ferredoxin eller flavodoxin, hvorved ROS fjernes og jern-svovlcentret genoprettes under oxidativ stress (Li et al. 2006). Det er blevet rapporteret, at både Fpr og SodA (SOD) i Pseudomonas kan induceres af oxidativ stress, og øgede SOD- og katalaseaktiviteter blev observeret i fire Pseudomonas-stammer (O1, W1, As1 og G1) under vækst under betingelser tilsat naftalen (Kang et al., 2006). Undersøgelser har vist, at tilsætning af antioxidanter såsom ascorbinsyre eller jern(II) (Fe2+) kan øge vækstraten for naftalen. Når Rhodococcus erythropolis voksede i naftalenmedium, øgedes transkriptionen af ​​oxidativt stressrelaterede cytochrom P450-gener, herunder sodA (Fe/Mn superoxiddismutase), sodC (Cu/Zn superoxiddismutase) og recA (Sazykin et al., 2019). Komparativ kvantitativ proteomisk analyse af Pseudomonas-celler dyrket i naftalen viste, at opregulering af forskellige proteiner forbundet med oxidativ stressrespons er en stresshåndteringsstrategi (Herbst et al., 2013).
Det er blevet rapporteret, at mikroorganismer producerer biosurfaktanter under påvirkning af hydrofobe kulstofkilder. Disse overfladeaktive stoffer er amfifile overfladeaktive forbindelser, der kan danne aggregater ved olie-vand- eller luft-vand-grænseflader. Dette fremmer pseudo-solubilisering og letter adsorptionen af ​​aromatiske kulbrinter, hvilket resulterer i effektiv bionedbrydning (Rahman et al., 2002). På grund af disse egenskaber anvendes biosurfaktanter i vid udstrækning i forskellige industrier. Tilsætning af kemiske overfladeaktive stoffer eller biosurfaktanter til bakteriekulturer kan forbedre effektiviteten og hastigheden af ​​kulbrintenedbrydning. Blandt de biosurfaktanter er rhamnolipider produceret af Pseudomonas aeruginosa blevet grundigt undersøgt og karakteriseret (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Derudover omfatter andre typer biosurfaktanter lipopeptider (muciner fra Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (fra Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg og Ron, 1999), trehalosedisaccharidlipider fra Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin fra Bacillus (Saraswathy og Hallberg, 2002) og overfladeaktivt stof fra Bacillus subtilis (Siegmund og Wagner, 1991) og Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Disse potente overfladeaktive stoffer har vist sig at reducere overfladespændingen fra 72 dyn/cm til mindre end 30 dyn/cm, hvilket muliggør bedre absorption af kulbrinter. Det er blevet rapporteret, at Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia og andre bakteriearter kan producere forskellige rhamnolipid- og glycolipidbaserede biosurfaktanter, når de dyrkes i naphthalen- og methylnaphthalenmedier (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 kan producere det ekstracellulære biosurfaktant Biosur-Pm, når det dyrkes på aromatiske forbindelser såsom naphthoesyre (Phale et al., 1995). Kinetikken for Biosur-Pm-dannelse viste, at dets syntese er en vækst- og pH-afhængig proces. Det blev fundet, at mængden af ​​Biosur-Pm produceret af celler ved neutral pH var højere end ved pH 8,5. Celler dyrket ved pH 8,5 var mere hydrofobe og havde højere affinitet for aromatiske og alifatiske forbindelser end celler dyrket ved pH 7,0. I Rhodococcus spp. N6, højere forhold mellem kulstof og nitrogen (C:N) og jernbegrænsning er optimale betingelser for produktion af ekstracellulære biosurfaktanter (Mutalik et al., 2008). Der er gjort forsøg på at forbedre biosyntesen af ​​biosurfaktanter (surfaktiner) ved at optimere stammer og fermentering. Titeren af ​​overfladeaktivt stof i dyrkningsmediet er imidlertid lav (1,0 g/L), hvilket udgør en udfordring for storskalaproduktion (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Derfor er genteknologiske metoder blevet anvendt til at forbedre dets biosyntese. Imidlertid er dets tekniske modifikation vanskelig på grund af operonens store størrelse (∼25 kb) og kompleks biosyntetisk regulering af quorum sensing-systemet (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). En række genteknologiske modifikationer er blevet udført i Bacillus-bakterier, primært med det formål at øge surfactinproduktionen ved at erstatte promoteren (srfA-operonen), overekspression af surfactin-eksportproteinet YerP og de regulatoriske faktorer ComX og PhrC (Jiao et al., 2017). Disse genteknologiske metoder har dog kun opnået en eller få genetiske modifikationer og har endnu ikke nået kommerciel produktion. Derfor er yderligere undersøgelse af vidensbaserede optimeringsmetoder nødvendig.
PAH-biologisk nedbrydningsundersøgelser udføres hovedsageligt under standard laboratorieforhold. På forurenede steder eller i forurenede miljøer har mange abiotiske og biotiske faktorer (temperatur, pH, ilt, næringsstoftilgængelighed, substratbiotilgængelighed, andre xenobiotika, hæmning af slutproduktet osv.) dog vist sig at ændre og påvirke mikroorganismers nedbrydningskapacitet.
Temperatur har en betydelig effekt på PAH-nedbrydningen. Når temperaturen stiger, falder koncentrationen af ​​opløst ilt, hvilket påvirker metabolismen af ​​aerobe mikroorganismer, da de kræver molekylært ilt som et af substraterne for oxygenaser, der udfører hydroxylering eller ringspaltningsreaktioner. Det bemærkes ofte, at forhøjet temperatur omdanner de oprindelige PAH'er til mere giftige forbindelser og derved hæmmer biologisk nedbrydning (Muller et al., 1998).
Det er blevet bemærket, at mange PAH-forurenede steder har ekstreme pH-værdier, såsom steder forurenet med sur minedrift (pH 1-4) og steder forurenet med naturgas/kulforgasning, der er forurenet med alkalisk perkolat (pH 8-12). Disse forhold kan have alvorlig indflydelse på den biologiske nedbrydningsprocessen. Derfor anbefales det, før mikroorganismer anvendes til bioremediering, at justere pH-værdien ved at tilsætte egnede kemikalier (med moderat til meget lavt oxidations-reduktionspotentiale) såsom ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat til alkaliske jorde eller kalkning med calciumcarbonat eller magnesiumcarbonat til sure steder (Bowlen et al. 1995; Gupta og Sar 2020).
Iltforsyning til det berørte område er den hastighedsbegrænsende faktor for PAH-biologisk nedbrydning. På grund af redoxforholdene i miljøet kræver in situ bioremedieringsprocesser normalt ilttilførsel fra eksterne kilder (jordbearbejdning, luftgennemstrømning og kemisk tilsætning) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) viste, at tilsætning af magnesiumperoxid (en iltfrigivende forbindelse) til et forurenet grundvandsmagasin effektivt kunne bioremediere BTEX-forbindelser. En anden undersøgelse undersøgte in situ-nedbrydningen af ​​phenol og BTEX i et forurenet grundvandsmagasin ved at injicere natriumnitrat og konstruere ekstraktionsbrønde for at opnå effektiv bioremediering (Bewley og Webb, 2001).