Nuværende†Nuværende adresse: OX11 0DE, Storbritannien, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Storbritannien, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Reaktionscenterets lyshøstningskompleks 1 (RC-LH1) er den centrale fotosyntetiske komponent i lilla fototrofiske bakterier. Vi introducerede to kryo-elektronmikroskopistrukturer af RC-LH1-komplekset fra Rhodopseudomonas palustris. 2,65 Å opløsningsstrukturen af ​​RC-LH114-W-komplekset består af 14 underenheds LH1-løkker, der omgiver RC, som er afbrudt af protein W, mens komplekset uden protein-W er fuldstændig RC-sammensætning omgivet af RC. Lukket 16 underenheds LH1-løkke. Sammenligningen af ​​disse strukturer giver indsigt i dynamikken af ​​quinon i RC-LH1-komplekset, herunder tidligere ubestemte konformationsændringer ved binding af quinon på RC QB-stedet, samt placeringen af ​​​​hjælpende quinonbindingssteder, som hjælper med at overføre dem til RC. Den unikke struktur af W-proteinet forhindrer lukningen af ​​LH1-løkken og skaber derved en kanal til at accelerere quinon/quinolon-udvekslingen.
Energien fra fotosyntese kan opretholde næsten alt liv på jorden, og den har et stort potentiale for solbioteknologi. Samtidig med at de fremmer global fotosyntese, udviser lilla fototrofiske bakterier også forskellige energiformer og metaboliske egenskaber. De kan undgå fotosyntese og vokse som heterotrofiske bakterier i mørke, kan fiksere nitrogen og kuldioxid, producere brint og nedbryde aromatiske forbindelser (1-3). For at kunne levere energi til disse processer skal lys hurtigt og effektivt omdannes til kemisk energi. Denne proces starter, når det lysfangende antennekompleks absorberer lys og overfører den fangede energi til reaktionscentret (RC), hvorved ladningsseparation starter (4-7). Den grundlæggende enhed i fotosyntese i lilla fototrofiske bakterier er sammensat af type 2 RC, omgivet af lyshøstende kompleks 1 (LH1), der danner RC-LH1-kernekomplekset. LH1 dannes af en række buede αβ-heterodimerer, som hver binder to bakterielle klorofyl (BChl) a-molekyler og en eller to carotenoider (8-12). Den enkleste LH1-antenne består af 16 eller 17 αβ-heterodimerer, der omgiver RC (9-13) i et lukket kredsløb, men i andre kernekomplekser afbryder transmembrane peptider kontinuiteten af ​​det omgivende LH1 og fremmer derved quinol/quinondiffusionen mellem RC og cytochrom bc1-komplekset (11, 13-15). Den lilla fototrofe plante Rhodopseudomonas (Rps.) er en modelorganisme, der kan forstå den energi- og elektronoverførsel, der understøtter fotosyntese. Den første krystalstruktur af Rps. Modellen af ​​palustris RC-LH1-komplekset er RC, omgivet af 15 heterodimeriske LH1-løkker, som er afbrudt af et ukendt protein kaldet "Protein W" (14). Protein-W blev efterfølgende identificeret som RPA4402, som er et ukarakteriseret 10,5 kDa protein med tre forudsagte transmembrane helixer (TMH) (16). Vi foreslår at omdøbe rpa4402-genet, der koder for protein W, til pufW for at være i overensstemmelse med den nomenklatur, der anvendes for gener, der koder for RC-L-, M- (pufL, pufM) og LH1α, β (pufA, pufB) underenheder. Interessant nok er protein-W kun til stede i omkring 10% af RC-LH1, hvilket afslører, at Rps. palustris producerer to forskellige RC-LH1-komplekser. Her rapporterer vi de højopløselige cryo-EM (cryo-EM) strukturer af to kernekomplekser, et med protein W og 14 αβ heterodimerer, det andet uden protein W og en lukket 16 Heterodimer LH1-løkke. Vores struktur repræsenterer et skridt i forståelsen af ​​RC-LH1-komplekset af Rps. palustris, fordi vi har analyseret den homogene population af hver variant og har tilstrækkelig opløsning til klart at tildele hvert peptid og bundne pigmenter og relaterede lipider og quinoner. Sammenligningen af ​​disse strukturer viser, at de tre TMH-proteiner-W, som hidtil ikke er fundet i noget andet RC-LH1-kompleks, genererer en quinonkanal for at accelerere quinon/quinolon-udvekslingen. En række konserverede lipid- og quinonbindingssteder er blevet identificeret, og vi har afsløret en ny konformationsændring efter kombinationen af ​​quinon og RC, som kan være egnet til fotosystem II (PSII) RC hos iltede fototrofiske organismer. Vores resultater giver ny indsigt i kinetikken af ​​quinon/quinolon-binding og -udveksling i RC-LH1-kernekomplekset hos lilla fototrofiske bakterier.
For at muliggøre en detaljeret undersøgelse af de to komplekser fundet i Rps. palustris, isolerer vi hver RC-LH1 ved hjælp af biokemiske metoder. Det protein W-deficiente kompleks (herefter benævnt ΔpufW) blev oprenset fra stammen, der mangler pufW-genet (16), og kun ét RC-LH1-kompleks kan produceres. Det protein W-holdige kompleks produceres af en stamme. Protein W'et fra denne stamme modificeres med et 10x His-mærke ved dens C-terminal, således at det protein W-holdige kompleks effektivt kan kombineres med det meste manglende protein W ved at immobilisere metal. Komplekset separeres effektivt (16) ved hjælp af affinitetskromatografi (IMAC).
Som vist i figur 1 indeholder begge komplekser en RC med tre underenheder (RC-L, RC-M og RC-H) omgivet af en LH1-antenne. 2,80-A-strukturen af ​​komplekset uden protein-W viser 16 αβ-heterodimerer, der danner en lukket LH1-løkke, der fuldstændigt omgiver RC, herefter benævnt RC-LH116-komplekset. 2,65 Å-strukturen af ​​det protein-W-holdige kompleks har en 14-heterodimer LH1 afbrudt af protein-W, herefter benævnt RC-LH114-W.
(A og B) Overfladerepræsentation af forbindelsen. (C og D) Bundne pigmenter udtrykt i stave. (E og F) Komplekserne observeret fra den cytoplasmatiske overflade har peptiderne og LH1-underenhederne repræsenteret i tegningerne og er nummereret med uret fra protein-W-gabet [i overensstemmelse med Rba-nummerering. sphaeroides-kompleks (13)]. For LH1-α er farven på proteinunderenheden gul; for LH1-β er farven på proteinunderenheden blå; for protein-W er proteinet rødt; for RC-H er det cyan; for RC-L er det orange; for RC-M er det magenta. Cofaktorer er repræsenteret af stave, grøn repræsenterer BChl- og BPha-molekyler, lilla repræsenterer carotenoider, og gul repræsenterer UQ10-molekyler. (G og H) Forstørret visning af protein-W-gabet i den ækvivalente region af RC-LH114-W-komplekset (G) og RC-LH116-komplekset (H). Kofaktorer vises i form af rumudfyldning, chelateret quinon vises med blåt. Protein-W-gabet er fremhævet med en blå stiplet linje i (G), og de små huller, hvor quinon/quinolol diffunderer på LH116-ringen, er fremhævet med en sort stiplet linje i (H).
Figur 1 (A og B) viser RC omgivet af åbne eller lukkede arrays af LH1αβ heterodimerer, som hver binder to BChl og en carotenoid (Figur 1, C og D). Tidligere undersøgelser har vist, at Rps er LH1-komplekset. I den biosyntetiske vej for spirulina xanthin indeholder disse arter blandede populationer af carotenoider (17). Imidlertid er spiropyrroxanthin den dominerende carotenoid, og dens densitet er tilfredsstillende. Derfor valgte vi at modellere spiroxanthin på alle LH1-bindingssteder. Alfa- og beta-polypeptiderne er enkelte TMH'er med korte ydre membranregioner (Figur 1, A, B, E og F). Selvom densiteten på 17 rester ved C-terminalen ikke blev observeret, blev alfa-polypeptidet spaltet fra Met1 til Ala46 i begge komplekser. β-polypeptidet blev reduceret fra Gly4 til Tyr52 i RC-LH116 og fra Ser5 til Tyr52 i RC-LH114-W. Der blev ikke observeret nogen tæthed af 3 eller 4 N-terminale eller 13 C-terminale rester (Figur S1). Massespektrometrianalyse af det blandede RC-LH1-kompleks fremstillet fra vildtypestammen viste, at den manglende region var resultatet af heterolog spaltning af disse peptider (Figur S1 og S2). N-terminal formylering af α-Met1 blev også observeret (f). Analysen viste, at α-peptidet består af resterne fMet1 til Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, og β-peptidet består af resterne Ser2 til Ala53, hvilket er i god overensstemmelse med lavtemperatur-EM-densitetskortet.
Koordination af α-His29 og β-His36 gør BChl'er ansigt til ansigt; hver αβ-heterodimer samles med sine naboer for at danne en åben sløjfe (RC-LH114-W) eller en lukket sløjfe (RC-LH116) omkring RC-det exciton-koblede pigmentarray (Figur 1, C og D). Sammenlignet med 877 nm-båndet for RC-LH114-W er 880 nm absorptionsrødforskydningen for RC-LH116 3 nm (Figur 2A). Det cirkulære dikroismespektrum er dog næsten det samme (Figur 2B), hvilket indikerer, at selvom der er en klar forskel mellem åbne og lukkede sløjfer, er det lokale miljø for BChl'er meget ens. Absorptionsrødforskydningen kan være resultatet af reduceret termisk bevægelse og øget stabilitet på den lukkede sløjfe (18, 19), ændringen i pigmentkobling forårsaget af den lukkede sløjfe (20, 21) eller en kombination af disse to effekter (11).
(A) Ultraviolet/synligt/nær-infrarødt absorptionsspektrum, hvis toppe er markeret med deres tilsvarende pigmenter og normaliseret til BPh-toppen ved 775 nm. (B) Cirkulært dikroismespektrum normaliseret til BChl-absorbans ved 805 nm. (C og D) Udvalgte ΔA-spektre fra de tidsopløste absorptionsspektre af RC-LH114-W-komplekset (C) og RC-LH116-komplekset (D). For bedre sammenlignelighed er alle spektre normaliseret til ∆A af −A ved 0,2 ps. (E) Hastigheden af ​​cytochrom c2-oxidation efter bestråling i nærvær af forskellige koncentrationer af UQ2 (se figur S8 for rådata). (F) I celler dyrket under lys med lav, medium eller høj intensitet (henholdsvis 10, 30 eller 300 μMm-2 s-1), protein W- og RC-L-underenhederne i det oprensede kompleks og det separerede membranforhold. Bestem proteinniveauet ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og immunoassay (se figur S9 for rådata). Bestem forholdet i forhold til det oprensede RC-LH114-W-kompleks. Det støkiometriske forhold mellem RC-L og protein-W i komplekset er 1:1.
BChl'erne i position 1 i det deformerede αβ14-loop i RC-LH114-W (Figur 1, A, C og E) er 6,8 Å tættere på RC'ens primære donor (P) end de tilsvarende BChl'er i RC-LH116 (Figur 1, B, D og F, og Figur S3); den transiente absorptionskinetik for de to komplekser viser dog, at for RC-LH114-W og RC-LH116 er excitationsenergioverføringstidskonstanterne fra LH1 til RC 40 ±4 og 44 ±3 ps (Figur 2, C og D, Figur S4 og Tabel S2). Der er heller ingen signifikant forskel i elektronisk overførsel inden for RC (Figur S5 og relateret supplerende tekst). Vi formoder, at den tætte overensstemmelse mellem energioverføringstiden mellem LH1 og RC-P skyldes den lignende afstand, vinkel og potentielle energi for de fleste BChl i de to LH1-loops. Det ser ud til, at det ikke er hurtigere at udforske LH1-energimønsteret for at nå den minimale afstand end direkte energioverførsel fra suboptimale steder til RC. LH1-løkken med åben løkke i RC-LH114-W kan også undergå ubetydelig termisk bevægelse under lave temperaturforhold til strukturel analyse, og der er en længere αβ14-ringkonformation ved stuetemperatur fra pigmenteringsafstanden for βBChls ved RC 1's position.
RC-LH116-komplekset indeholder 32 BChl'er og 16 carotenoider, og dets overordnede arrangement er det samme som det, der opnås fra Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stamme (PDB ID 7C9R) (12) og grønne alger (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Efter justering blev der kun observeret små afvigelser i positionerne af αβ-heterodimerer, især 1-5, 15 og 16 (Figur S6). Tilstedeværelsen af ​​protein-W har en betydelig indflydelse på strukturen af ​​LH1. Dets tre TMH'er er forbundet med korte løkker, med N-terminalen på lumensiden af ​​komplekset og C-terminalen på den cytoplasmatiske side (Figur 1A og 3, A til D). Protein-W er i vid udstrækning hydrofobt (Figur 3B), og TMH2 og TMH3 interagerer med LH1αβ-14 og danner en transmembran overflade (Figur 3, B og E til G). Grænsefladen består hovedsageligt af Phe-, Leu- og Val-rester i transmembranregionen. Disse rester er stablet med hydrofobe aminosyrer og αβ-14-pigmenter. Nogle polære rester bidrager også til interaktionen, herunder hydrogenbindingen mellem W-Thr68 og β-Trp42 på overfladen af ​​det komplekse hulrum (Figur 3, F og G). På overfladen af ​​cytoplasmaet støder Gln34 op til ketogruppen af ​​αβ-14-carotenoider. Derudover blev n-dodecyl β-d-maltosid (β-DDM)-molekylet opløst, og dets hydrofobe hale strakte sig til grænsefladen mellem protein-W og αβ-14, og lipidhalen kan være placeret i kroppen. Vi bemærkede også, at de C-terminale resolutionsregioner af protein W og RCH er meget tæt på hinanden, men ikke inden for rammerne af dannelse af specifikke interaktioner (Figur 1, A og E). Der kan dog være interaktioner i de uopløste C-terminale aminosyrer af disse to proteiner, hvilket kan give en mekanisme for rekruttering af protein-W under samlingen af ​​RC-LH114-W-komplekset.
(A) Protein-W, som vender mod grænsefladen med LH1αβ14 i tegneserieform, har en stavformet sidekæde (rød), vist i en del af det elektrostatiske potentialdiagram (transparent grå overflade med et konturniveau på 0,13). (B) Protein-W repræsenteret af en hydrofob farvet overflade. Polære og ladede områder vises i cyan, hydrofobe områder vises i hvid, og stærkt hydrofobe områder vises i orange. (C og D) Protein-W repræsenteret i tegneserien, dets orientering er den samme som i (A) (C) og roteret med 180° (D). I henhold til positionen i sekvensen antager de skelnelige rester et regnbuefarveskema, hvor N-terminalen er blå og C-terminalen er rød. (E) Protein-W i samme visning som i (A), og resterne ved grænsefladen mellem protein-W:LH1 er repræsenteret af stave med påsatte markeringer. (F) Protein-W er roteret 90° i forhold til (E) og LH1αβ14 i tegneserierepræsentationen og i forhold til grænsefladeresterne i søjlerepræsentationen. De overhængende rester fra beta-polypeptidet er mærket. Cofaktoren er vist som en søjle, der matcher farven i figur 1, den dekomponerede β-DDM er vist med gråt, og oxygenet er vist med rødt. (G) Visningen i (F) er roteret 180° med de fremtrædende rester af det mærkede alfa-polypeptid.
Protein-W erstatter en αβ heterodimer (den 15. i figur 1F), hvorved løkkelukning forhindres og de første tre αβ heterodimerer vippes. Det blev observeret, at den maksimale hældningsvinkel for den første αβ-1 heterodimer i forhold til filmnormalen var 25° til 29° (figur 1, A og E), hvilket blev dannet af hældningen på 2° til 8° af αβ-1 i RC A sharp contrast-LH116 (figur 1, B og F). Den anden og tredje heterodimer hælder henholdsvis 12° til 22° og 5° til 10°. På grund af den steriske hindring af RC inkluderer hældningen af ​​αβ-1 ikke det andet par af αβ (som svarer til den 16. αβ i figur 1F), hvilket danner et tydeligt mellemrum i LH1-ringen (figur 1, A og E). På grund af manglen på to αβ-heterodimerer, ledsaget af tabet af fire BChl og to carotenoider, binder ingen af ​​carotenoiderne sig til den snoede αβ-1-underenhed, hvilket resulterer i en LH114-W-ring, der indeholder 13 vegetariske carotenoider og 28 BChl. De lokale opløsningsestimater for de to komplekser i regionerne αβ1 til 7 er lavere end for resten af ​​LH1-løkken, hvilket kan afspejle den iboende plasticitet af LH1-underenheden ved siden af ​​RC QB-stedet (Figur 4).
Billederne af RC-LH114-W (A og B) og RC-LH116 (C og D) er vist fra den samme top-/sidevisning (A og B) (A og C) og kavitetsoverflade som vist i figur 1 (B og D). De farvede taster er vist til højre.
Det eneste andet karakteristiske kernekompleks med et støkiometrisk forhold på 1:14 er Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX-dimeren (13). Protein W og PufX har dog ingen åbenlys homologi og har en betydelig indflydelse på deres respektive LH1-strukturer. PufX er en enkelt TMH med et N-terminalt cytoplasmatisk domæne, der interagerer med den cytoplasmatiske side af RC-H-underenheden (13) på en position svarende til Rps. palustris LH116αβ-16. PufX skaber en kanal til quinon/quinolon-udvekslingen mellem RC-LH1 og cytochrom bcl-komplekset og er til stede i alle Rba. sphaeroides-kernekomplekser (13). Selvom monomer-monomer-grænsefladen er i Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX-dimeren er placeret ved bindingspositionen for protein W i RC-LH114-W, og gabet induceret af PufX og protein-W er på en ækvivalent position (Figur S7A). Gabet i RC-LH114-W er også justeret med den hypotetiske quinonkanal (8) i Pseudomonas rosea LH1, som er dannet af peptider, der ikke er relateret til protein W eller PufX (Figur S7B). Derudover er quinonkanalen i Blc. Den smaragdgrønne LH1 dannet ved at udelukke en γ-underenhed (7) er placeret i en lignende position (Figur S7C). Selvom det medieres af forskellige proteiner, synes forekomsten af ​​disse quinon/quinolol-kanaler i en fælles position i RC-LH1-komplekset at være et eksempel på konvergent evolution, hvilket indikerer, at gabet skabt af protein W kan fungere som en quinonkanal.
Gabet i LH114-W-løkken tillader dannelsen af ​​et kontinuerligt membranområde mellem det indre rum i RC-LH114-W-komplekset og hovedmembranen (Figur 1G) i stedet for at forbinde de to domæner gennem en proteinpore, som i proteiner. RC-LH116-komplekset ligner et lukket Tch.-nålelignende kompleks (22) (Figur 1H). Da diffusionen af ​​quinon gennem membranen er hurtigere end diffusionen gennem den smalle proteinkanal, kan den åbne LH114-W-løkke tillade hurtigere RC-omsætning end den lukkede LH116-løkke, og diffusionen af ​​quinon ind i RC kan være mere begrænset. For at teste, om protein W påvirker omdannelsen af ​​quinoner gennem RC, udførte vi et cytokromoxidationsassay på en bestemt koncentration af ubiquinon 2 (UQ2) (en analog af naturlig UQ10 med en kortere isoprenhale) (Figur 2E). Selvom tilstedeværelsen af ​​chelateret quinon hindrer den nøjagtige bestemmelse af den tilsyneladende Michaelis-konstant (RC-LH114-W og RC-LH116 er egnede til henholdsvis 0,2 ± 0,1 μM og 0,5 ± 0,2 μM), er den maksimale hastighed for RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5 % større end RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Vi estimerede oprindeligt, at protein-W er til stede i omkring 10% af kernekomplekset (16); her er belægningsraterne for vækstceller med svagt lys, mellemlys og højt lys henholdsvis 15 ± 0,6%, 11 ± 1% og 0,9 ± 0,5% (Figur 2F). Kvantitativ sammenligning af massespektrometri viste, at tilsætningen af ​​histidinmærke ikke reducerede den relative mængde protein-W sammenlignet med vildtypestammer (P = 0,59), så disse niveauer er ikke en artefakt af modificeret protein-W (Figur S10). Denne lave belægningsgrad af protein-W i RC-LH1-komplekset kan dog tillade nogle RC'er at skifte med en accelereret hastighed og derved mindske den langsommere quinon/quinolon-udveksling i RC-LH116-komplekset. Vi bemærkede, at belægningsgraden med højt lys er inkonsistent med de nylige transkriptomiske data, hvilket indikerer, at pufW-genekspression stiger under stærkt lys (Figur S11) (23). Forskellen mellem pufW-transkription og protein-W-inkorporering i RC-LH1-komplekset er forvirrende og kan afspejle proteinets komplekse regulering.
I RC-LH114-W er 6 cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholin (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) og 29 β-DDM-molekyler allokeret og modelleret i den: 6 CDL'er, 24 POPC'er, 2 POPG'er og 12 βDDM'er. RC-LH116 (Figur 5, A og B). I disse to strukturer er CDL næsten placeret på den cytoplasmatiske side af komplekset, mens POPC, POPG og β-DDM for det meste er placeret på den luminale side. To lipid- og detergentmolekyler blev isoleret i αβ-1 til αβ-6-regionen af ​​RC-LH114-W-komplekset (Figur 5A), og fem blev isoleret i den ækvivalente region af RC-LH116 (Figur 5B). Flere lipider blev fundet på den anden side af komplekset, primært CDL, akkumuleret mellem RC og αβ-7 til αβ-13 (Figur 5, A og B). Andre strukturelt opløste lipider og detergenter er placeret uden for LH1-ringen, og velopløste acylkæder strækker sig mellem LH1-underenheder, foreløbigt betegnet som β-DDM i RC-LH114-W, og defineret som β-DDM i RC En blanding af β-DDM og POPC-LH116. De lignende positioner af chelaterende lipider og detergenter i vores struktur indikerer, at de er fysiologisk relevante bindingssteder (Figur S12A). Positionerne af ækvivalente molekyler i Tch har også god konsistens. Gentle og Trv. Stamme 970 RC-LH1'er (Figur S12, B til E) (9, 12) og hydrogenbindingsresterne i lipidhovedgruppen udviste ret god konservering i sekvensjusteringen (Figur S13), hvilket indikerer, at konserverede CDL, der binder til RC (24), kan være konserverede i RC-LH1-komplekset.
(A og B) RC-LH114-W (A) og RC-LH116 (B) peptider er repræsenteret af tegneserier, og pigmenterne er repræsenteret af stave, ved hjælp af farveskemaet i figur 1. Lipider er vist med rødt, og detergenter er vist med gråt. UQ bundet til RC QA- og QB-steder er gul, mens isoleret UQ er blå. (C og D) De samme visninger som (A) og (B), med lipider udeladt. (E til G) Forstørret visning af Q1(E), Q2(F) og Q3(G) fra RC-LH116, med sidekæder, der påvirker hinanden. Hydrogenbindingerne er vist som sorte stiplede linjer.
I RC-LH116 nedbrydes både RC QA og QB UQ, som deltager i elektronoverførsel i ladningsseparationsprocessen, i deres bindingssteder. I RC-LH114-W er QB-quinon imidlertid ikke blevet opløst og vil blive diskuteret detaljeret nedenfor. Ud over QA- og QB-quinoner er to chelaterede UQ-molekyler (placeret mellem RC- og LH1-ringene) allokeret i RC-LH114-W-strukturen i henhold til deres velopløste hovedgrupper (placeret i henholdsvis Q1 og Q2). Figur 5C). To isoprenenheder er tildelt Q1, og densitetskortet opløser de komplette 10 isoprenhaler i Q2. I strukturen af ​​RC-LH116 blev tre chelaterede UQ10-molekyler (Q1 til Q3, figur 5D) opløst, og alle molekyler har en klar densitet i hele halen (figur 5, D til G). I de to strukturer har positionerne af quinon-hovedgrupperne i Q1 og Q2 fremragende konsistens (Figur S12F), og de interagerer kun med RC. Q1 er placeret ved indgangen til W-gabet i RC-LH114-W (Figur 1G og 5, C, D og E), og Q2 er placeret nær QB-bindingsstedet (Figur 5, C, D) og F). De konserverede L-Trp143- og L-Trp269-rester er meget tæt på Q1 og Q2 og giver potentielle π-stablingsinteraktioner (Figur 5, E og F, og Figur S12). L-Gln88, 3,0 Å fra det distale ilt i Q1, giver en stærk hydrogenbinding (Figur 5E); denne rest er konserveret i alle RC'er undtagen det fjerneste forhold (Figur S13). L-Ser91 er konservativt substitueret med Thr i de fleste andre RC'er (Figur S13), er 3,8 Ångstrøm fra methyloxygenet i Q1 og kan give svage hydrogenbindinger (Figur 5E). Q3 synes ikke at have en specifik interaktion, men er placeret i den hydrofobe region mellem RC-M-underenheden og LH1-α-underenheden 5 til 6 (Figur 5, D og G). Q1, Q2 og Q3 eller nærliggende chelaterede quinoner er også blevet adskilt i Tch. Gentle, Trv. Stamme 970 og Blc. Irisstrukturen (9, 10, 12) peger på et bevaret hjælpequinonbindingssted i RC-LH1-komplekset (Figur S12G). De fem dekomponerede UQ'er i RC-LH116 er i god overensstemmelse med 5,8 ± 0,7 for hvert kompleks bestemt ved højtydende væskekromatografi (HPLC), mens de tre dekomponerede UQ'er i RC-LH114-W er lavere end. Den målte værdi på 6,2 ± 0,3 (fig. S14) indikerer, at der er uopløste UQ-molekyler i strukturen.
De pseudosymmetriske L- og M-polypeptider indeholder hver fem TMH'er og danner en heterodimer, der kombinerer en BChl-dimer, to BChl-monomerer, to bakteriofag (BPh)-monomerer og en ikke-hæmjern- og en eller to UQ10-molekyler. Gennem tilstedeværelsen af ​​hydrogenbindinger på den terminale ketongruppe og dens kendte akkumulering i Rps inkorporeres carotenoider i M-underenheden, som kaldes cis-3,4-dehydroorhodopin. Arter (25). Det ydre membrandomæne af RC-H er forankret til membranen af ​​en enkelt TMH. Den overordnede RC-struktur ligner de tre underenheder RC af beslægtede arter (såsom Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocyklerne af BChl og BPh, carotenoid-rygraden og ikke-hæmjern overlapper hinanden inden for opløsningsområdet for disse strukturer, ligesom UQ10-hovedgruppen ved QA-stedet og QB-quinonen ved RC-LH116 (Figur S15).
Tilgængeligheden af ​​to RC-strukturer med forskellige QB-stedsbelægningsrater giver en ny mulighed for at undersøge de konsistente konformationsændringer, der ledsager QB-quinonbinding. I RC-LH116-komplekset er QB-quinon placeret i den fuldt bundne "proksimale" position (26), men separationen af ​​RC-LH114-W indeholder ikke QB-quinon. Der er ingen QB-quinon i RC-LH114-W, hvilket er overraskende, fordi komplekset er mere aktivt end RC-LH116-komplekset med strukturelt opløst QB-quinon. Selvom de to LH1-ringe chelaterer omkring seks quinoner, er fem strukturelt opløst i den lukkede RC-LH116-ring, mens kun tre er strukturelt begrænsede i den åbne RC-LH114-W-ring. Denne øgede strukturelle uorden kan afspejle den hurtigere udskiftning af RC-LH114-W QB-steder, hurtigere quinonkinetik i komplekset og øget sandsynlighed for at krydse LH1-løkken. Vi foreslår, at manglen på UQ i RC QB-stedet for RC-LH114-W kan være resultatet af et mere komplekst og mere aktivt kompleks, og at QB-stedet for RC-LH114-W er blevet øjeblikkeligt fastfrosset i UQ-omsætningen. Det specifikke stadie (indgangen til QB-stedet er blevet lukket) afspejler konformationen af ​​denne aktivitet.
Uden QB følger den ledsagende rotation af L-Phe217 til en position, der er uforenelig med UQ10-binding, fordi det vil forårsage en rumlig kollision med den første isoprenenhed i halen (Figur 6A). Derudover er de åbenlyse primære konformationsændringer tydelige, især helix de (kort helix i løkken mellem TMH D og E), hvor L-Phe217 forskydes til QB-bindingslommen, og rotationen af ​​L-Tyr223 (Figur 6A) bryder hydrogenbindingen med M-Asp45-rammen og lukker indgangen til QB-bindingsstedet (Figur 6B). Helix de drejer ved sin base, Cα i L-Ser209 forskydes med 0,33 Å, mens L-Val221Cα forskydes med 3,52 Å. Der er ingen observerbare ændringer i TMH D og E, som er overlejrede i begge strukturer (Figur 6A). Så vidt vi ved, er dette den første struktur i den naturlige RC, der lukker QB-stedet. En sammenligning med den komplette (QB-bundne) struktur viser, at før quinonen reduceres, kræves der en konformationsændring for at få den til at trænge ind i quinonen. L-Phe217 roterer for at danne en π-stablingsinteraktion med quinon-hovedgruppen, og helixen forskydes udad, hvilket tillader skelettet af L-Gly222 og sidekæden af ​​L-Tyr223 at danne et hydrogenbindingsnetværk med en stabil hydrogenbindingsstruktur (Figur 6, A og C).
(A) Overlappende tegneserie af hologram (L-kæde, orange/M-kæde, magenta) og apo (grå) struktur, hvor nøgleresterne vises i form af en stavlignende repræsentation. UQ10 er repræsenteret af en gul bjælke. Den stiplede linje angiver de hydrogenbindinger, der er dannet i hele strukturen. (B og C) Overfladerepræsentationen af ​​apolipoproteinet og hele ringstrukturen, der fremhæver sidekædeoxygenet i L-Phe217 i blåt og L-Tyr223 i rødt, henholdsvis. L-underenheden er orange; M- og H-underenhederne er ikke farvede. (D og E) Apolipoprotein (D) og hele (E) RC QB-steder [farv med henholdsvis (A)] og Thermophilus thermophilus PSII (grøn, blå med plastisk quinon; PDB ID: 3WU2) Juster (58).
Uventet nok, selvom adskillige strukturer af QB-deficiente RC'er uden LH1 er tilgængelige, er de konformationsændringer, der observeres i dette studie, ikke tidligere blevet rapporteret. Disse inkluderer QB-udtømningsstrukturen fra Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) og Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), som alle er næsten de samme som deres overordnede QB-struktur. Nøje inspektion af 3PRC afslørede, at LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) detergentmolekyler binder ved indgangen til QB-positionen, hvilket kan forhindre omlejring til en lukket konformation. Selvom LDAO ikke nedbrydes i samme position i 1EYS eller 1OGV, fremstilles disse RC'er ved hjælp af det samme detergent og kan derfor producere den samme effekt. Krystalstrukturen af ​​Rba. Sphaeroides RC co-krystalliseret med cytochrom c2 (PDB ID: 1L9B) synes også at have et lukket QB-sted. I dette tilfælde antager den N-terminale region af RC-M-polypeptidet (som interagerer med QB-bindingsstedet gennem H-bindingen i Tyr-resten på Q-helixen) imidlertid en unaturlig konformation, og QB-konformationsændringen er ikke yderligere udforsket (30). Det er betryggende, at vi ikke har set denne form for deformation af M-polypeptidet i RC-LH114-W-strukturen, som er næsten den samme som den N-terminale region af RC-LH116 RC. Det skal også bemærkes, at efter udryddelse af den detergentbaserede LH1-antenne blev apolipoprotein-RC'erne i PDB opløst, hvilket eliminerede de interne quinonpuljer og lipider i mellemrummet mellem RC og den indre overflade af den omgivende LH1-ring (31, 32). RC forbliver funktionel, fordi den bevarer alle cofaktorer, bortset fra den nedbrydelige QB-quinon, som er mindre stabil og ofte går tabt under fremstillingsprocessen (33). Derudover er det kendt, at fjernelsen af ​​LH1 og naturlige cykliske lipider fra RC kan have en indvirkning på funktioner, såsom den forkortede levetid for den ladningsseparerede P+QB-tilstand (31, 34, 35). Derfor spekulerer vi i, at eksistensen af ​​den lokale LH1-ring, der omgiver RC, kan opretholde det "lukkede" QB-sted og derved bevare det lokale miljø nær QB.
Selvom apolipoprotein (uden QB-quinon) og den komplette struktur kun repræsenterer to øjebliksbilleder af omsætningen af ​​QB-stedet snarere end en række begivenheder, er der indikationer på, at bindingen kan styres for at forhindre rebinding af hydroquinon for at hæmme substrathæmning. Interaktionen mellem quinolol og quinon nær apolipoproteinets QB-sted kan være forskellig, hvilket fører til dets afstødning af RC. Det har længe været foreslået, at konformationsændringer spiller en rolle i binding og reduktion af quinoner. Frosne RC'ers evne til at reducere quinoner efter mørketilpasning er forringet (36); Røntgenkrystallografi viser, at denne skade skyldes, at QB-quinoner er fanget i en "distal" konformation omkring 4,5 Å fra den aktive proximale position (26, 37). Vi foreslår, at denne distale bindingskonformation er et øjebliksbillede af den mellemliggende tilstand mellem apolipoprotein og den komplette ringstruktur, som følger den indledende interaktion med quinon og åbningen af ​​QB-stedet.
Type II RC, der findes i PSII-komplekset hos visse fototrofiske bakterier og cyanobakterier, alger og planter, har strukturel og funktionel konservering (38). Den strukturelle tilpasning vist i figur 6 (D og E) understreger ligheden mellem PSII RC'er og QB-stedet i det bakterielle RC-kompleks. Denne sammenligning har længe været en model for at studere de nært beslægtede systemer for quinonbinding og -reduktion. Tidligere publikationer har antydet, at konformationsændringer ledsages af PSII-reduktion af quinoner (39, 40). I betragtning af den evolutionære konservering af RC kan denne tidligere uobserverede bindingsmekanisme derfor også være anvendelig på QB-stedet for PSII RC i iltede fototrofiske planter.
Rps ΔpufW (umærket pufW-deletion) og PufW-His (C-terminal 10x His-mærket protein-W udtrykt fra det naturlige pufW-locus) stammer. palustris CGA009 blev beskrevet i vores tidligere arbejde (16). Disse stammer og den isogene vildtype-forælder blev udvundet fra fryseren ved at udstryge et lille antal celler på PYE (hver 5 g liter-1) (opbevaret i LB ved -80 °C, indeholdende 50% (w/v) glycerol) protein, gærekstrakt og succinat) agar [1,5% (w/v)] plade. Pladen blev inkuberet natten over i mørke ved stuetemperatur under anaerobe forhold og derefter belyst med hvidt lys (~50 μmolm-2 s-1) leveret af OSRAM 116-W halogenpærer (RS Components, UK) i 3 til 5 dage, indtil en enkelt koloni fremkom. En enkelt koloni blev anvendt til at inokulere 10 ml M22+ medium (41) tilsat 0,1% (w/v) casaminosyrer (herefter benævnt M22). Kulturen blev dyrket under iltfattige forhold i mørke ved 34°C med omrystning ved 180 rpm i 48 timer, og derefter blev 70 ml af kulturen inokuleret under de samme forhold i 24 timer. En semi-aerob kultur med et volumen på 1 ml anvendes til at inokulere 30 ml M22 medium i en 30 ml universal skruelåg transparent glasflaske og bestrålet med omrøring (~50 μmolm-2 s-1) i 48 timer med en steril magnetisk omrører. Derefter blev 30 ml af kulturen inokuleret med ca. 1 liter kultur under de samme forhold, som derefter blev anvendt til at inokulere ca. 9 liter kultur belyst ved ~200 μmolm-2 s-1 i 72 timer. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 7132 RCF i 30 minutter, resuspenderet i ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og opbevaret ved -20 °C indtil brug.
Efter optøning tilsættes nogle krystaller af deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozym (Merck, UK) og to Roche holoenzymproteasehæmmertabletter (Merck, UK) til de resuspenderede celler. I en 20.000 psi French pressure cell (Aminco, USA) blev cellerne sprængt 8 til 12 gange. Efter fjernelse af ubrudte celler og uopløseligt debris ved centrifugering ved 18.500 RCF i 15 minutter ved 4°C, blev membranen udfældet fra det pigmenterede lysat ved centrifugering ved 113.000 RCF i 2 timer ved 43.000°C. Kassér den opløselige fraktion, og resuspender den farvede membran i 100 til 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og homogeniser, indtil der ikke er synlige aggregater. Den suspenderede membran blev inkuberet i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) indeholdende 2% (w/v) β-DDM i 1 time i mørke ved 4°C under forsigtig omrøring. Centrifuger derefter ved 70°C for at opløse 150.000 RCF ved 4°C i 1 time for at fjerne resterende uopløselige stoffer.
Den solubiliserende membran fra ΔpufW-stammen blev påført en 50 ml DEAE Sepharose-ionbytningssøjle med tre søjlevolumener (CV) bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 0,03% (w/v) β-DDM]. Vask søjlen med to CV-bindingsbuffere, og vask derefter søjlen med to bindingsbuffere indeholdende 50 mM NaCl. RC-LH116-komplekset blev elueret med en lineær gradient på 150 til 300 mM NaCl (i bindingsbuffer) på 1,75 CV, og det resterende bindingskompleks blev elueret med en bindingsbuffer indeholdende 300 mM NaCl på 0,5 CV. Opsaml absorptionsspektret mellem 250 og 1000 nm, behold fraktionen med et absorbansforhold (A880/A280) større end 1 ved 880 til 280 nm, fortynd den to gange i bindingsbufferen, og brug den samme procedure igen på DEAE-kolonnen ved oprensning. Fortynd fraktionerne med A880/A280-forhold højere end 1,7 og A880/A805-forhold højere end 3,0, udfør den tredje runde ionbytning, og behold fraktioner med A880/A280-forhold højere end 2,2 og A880/A805-forhold højere end 5,0. Det delvist oprensede kompleks blev koncentreret til ~2 ml i et Amicon 100.000 molekylvægtsgrænse (MWCO) centrifugalfilter (Merck, Storbritannien) og påført en Superdex 200 16/600 størrelseseksklusionskolonne (GE Healthcare, USA) indeholdende 200 mM NaCl-buffer og derefter elueret i den samme buffer ved 1,5 CV. Indsaml absorptionsspektrene for størrelseseksklusionsfraktionen, og koncentrer absorptionsspektrene med A880/A280-forhold over 2,4 og A880/A805-forhold over 5,8 til 100 A880, og brug dem straks til cryo-TEM-gitterforberedelse eller opbevaring. Opbevares ved -80 °C indtil brug.
Den solubiliserende membran fra PufW-His-stammen blev påført en 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-søjle (20 mM tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 200 mM NaCl og 0,03% (w/w)) i IMAC-buffer (GE Healthcare). (v) β-DDM. Søjlen blev vasket med fem CV'er IMAC-buffer og derefter med fem CV'er IMAC-buffer indeholdende 10 mM histidin. Kernekomplekset blev elueret fra søjlen med fem IMAC-buffere indeholdende 100 mM histidin. Fraktionen indeholdende RC-LH114-W-komplekset koncentreres til ~10 ml i en omrørt tank udstyret med et Amicon 100.000 MWCO-filter (Merck, UK), fortyndes 20 gange med bindingsbuffer og tilsættes derefter til 25 ml. I DEAE Sepharose-søjlen anvendes fire CV'er bundet til bufferen på forhånd. Vask kolonnen med fire CV-bindingsbuffere, og eluer derefter komplekset på otte CV'er på en lineær gradient på 0 til 100 mM NaCl (i bindingsbuffer), og de resterende fire CV'er indeholdende 100 mM bindingsbuffer. De resterende komplekser elueret på natriumchlorid kombineret med A880/A280-forholdet højere end 2,4 og A880/A805-forholdet højere end 4,6 fraktioner blev koncentreret til ~2 ml i et Amicon 100.000 MWCO centrifugalfilter og fyldt med 1,5 CV IMAC på forhånd. Bufferækvilibreret Superdex 200 16/600 størrelseseksklusionskolonne og derefter elueret i den samme buffer over 1,5 CV. Indsaml absorptionsspektrene for størrelseseksklusionsfraktionerne, og koncentrer absorptionsspektrene med A880/A280-forhold over 2,1 og A880/A805-forhold over 4,6 til 100 A880, som straks anvendes til forberedelse af frossent TEM-gitter eller opbevares ved -80 °C indtil behov.
En Leica EM GP nedsænkningsfryser blev brugt til at fremstille lavtemperatur TEM-gitre. Komplekset blev fortyndet i IMAC-buffer til A880 på 50, og derefter blev 5 μl påført et nyligt glødeudladet QUANTIFOIL 1.2/1.3 kulstofbelagt kobbernet (Agar Scientific, UK). Inkuber gitteret ved 20 °C og 60 % relativ luftfugtighed i 30 sekunder, dup det derefter tørt i 3 sekunder, og køle det derefter af i flydende ethan ved -176 °C.
Dataene fra RC-LH114-W-komplekset blev optaget på eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) med et Titan Krios-mikroskop, der arbejder ved en accelerationsspænding på 300 kV, med en nominel forstørrelse på 130.000× og en energi på - Vælg et mellemrum på 20 eV. En Gatan 968 GIF Quantum med K2 peak-detektor blev brugt til at optage billeder i tælletilstand for at indsamle data. Den kalibrerede pixelstørrelse er 1,048 Å, og dosishastigheden er 3,83 e-Å-2s-1. Filmen blev indsamlet på 11 sekunder og opdelt i 40 dele. Brug det kulstofbelagte område til at refokusere mikroskopet, og opsaml derefter tre film pr. hul. I alt blev der indsamlet 3130 film med defokuseringsværdier mellem -1 og -3 μm.
Dataene for RC-LH116-komplekset blev indsamlet ved hjælp af det samme mikroskop på Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, Storbritannien). Dataene blev indsamlet i tælletilstand med en forstørrelse på 130 k, og pixelstørrelsen blev kalibreret til 1,065 Å med en dosis på 4,6 e-Å-2s-1. Filmen blev optaget på 12 sekunder og opdelt i 48 dele. I alt blev der indsamlet 3359 film med defokuseringsværdier mellem -1 og -3 μm.
Al databehandling udføres i Relion 3.0-pipelinen (42). Brug Motioncorr 2 (43) til at korrigere strålebevægelsen ved dosisvægtning, og brug derefter CTFFIND 4.1 (44) til at bestemme CTF-parameteren (contrast transfer function). Typiske fotomikrografer efter disse indledende behandlingstrin er vist i figur 2. S16. Den automatiske udvælgelsesskabelon genereres ved manuelt at vælge omkring 250 pixels af 1000 partikler i en 250-pixel ramme og ingen reference todimensionel (2D) klassificering, hvorved de klassificeringer, der opfylder prøvekontaminering eller ikke har nogen mærkbare karakteristika, afvises. Derefter blev automatisk udvælgelse udført på alle mikrofotografierne, og RC-LH114-W var 849.359 partikler, og RC-LH116-komplekset var 476.547 partikler. Alle udvalgte partikler har gennemgået to runder med ikke-reference 2D-klassificering, og efter hver kørsel bliver de partikler, der opfylder kravene i kulstofområdet, har prøvekontaminering, ingen tydelige træk eller stærkt overlappende partikler, afvist, hvilket resulterer i henholdsvis 772.033 (90,9%) og 359.678 (75,5%). Partiklerne bruges til 3D-klassificering af henholdsvis RC-LH114-W og RC-LH116. Den indledende 3D-referencemodel blev genereret ved hjælp af den stokastiske gradient descent-metode. Ved at bruge den indledende model som reference klassificeres de udvalgte partikler i fire kategorier i 3D. Ved at bruge modellen i denne kategori som reference udføres 3D-raffinering på partiklerne i den største kategori, hvorefter det indledende 15 Å lavpasfilter bruges til at dække opløsningsmiddelområdet, der tilføjes 6 pixels bløde kanter, og pixels efterbehandles for at korrigere Gatan K2 peak Modulation-overføringsfunktionen for den øverste detektor. For RC-LH114-W datasættet blev denne indledende model modificeret ved at fjerne den stærke tæthed ved maskens kanter (afkoblet fra kernens komplekse tæthed i UCSF Chimera). De resulterende modeller (opløsningerne for RC-LH114-W og RC-LH116 er henholdsvis 3,91 og 4,16 Å) bruges som reference for anden runde af 3D-klassificering. De anvendte partikler er grupperet i den indledende 3D-klasse og indeholder ikke stærk korrelation med nabolaget. Overlapning eller mangel på åbenlyse strukturelle træk. Efter anden runde af 3D-klassificering blev kategorien med den højeste opløsning valgt [For RC-LH114-W er én kategori 377.703 partikler (44,5%), for RC-LH116 er der to kategorier, i alt 260.752 partikler (54,7%), hvor de kun er ens, når de justeres efter den indledende rotation med en lille forskel]. De udvalgte partikler genekstraheres i en 400-pixel boks og raffineres ved 3D-raffinering. Opløsningsmiddelmasken genereres ved hjælp af det indledende 15 Å lavpasfilter, 3 pixel kortudvidelse og 3 pixel blød maske. Ved hjælp af CTF-raffinering pr. partikel, bevægelseskorrektion pr. partikel og den anden runde af CTF-raffinering pr. partikel udføres 3D-raffinering, opløsningsmiddelmaskering og efterbehandling efter hvert trin for yderligere at raffinere den resulterende tekstur. Ved hjælp af FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off-værdien på 0,143 er opløsningerne for de endelige modeller af RC-LH114-W og RC-LH116 henholdsvis 2,65 og 2,80 Å. FSC-kurven for den endelige model er vist i figur 2. S17.
Alle proteinsekvenser er downloadet fra UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) blev brugt til at konstruere en homologimodel af RC, som indeholder proteinsekvenserne af RC-L, RC-M og RC-H samt krystalstrukturen af ​​Rba. sphaeroides RC blev brugt som skabelon (PDB ID: 5LSE) (46). Brug "fit map"-værktøjet i UCSF Chimera til at tilpasse den genererede model til kortet (47), forbedre proteinstrukturen, og tilføj cofaktoren [4×BChl a (monomerbibliotekets restnavn = BCL), 2×BPh a (BPH), en eller to slags UQ10 (U10), et ikke-hæmjern (Fe) og et 3,4-dihydrohexacarbonylcholin (QAK)]. Brug Coot (48) til at tilføje. Da QAK ikke er tilgængelig i monomerbiblioteket, blev den parametriseret ved hjælp af eLBOW-værktøjet i PHENIX (49).
Dernæst blev LH1-underenheden konstrueret. I starten blev det automatiske konstruktionsværktøj i PHENIX (49) brugt til automatisk at konstruere en del af LH1-sekvensen ved hjælp af kortet og LH1-α- og LH1-β-proteinsekvenserne som input. Vælg den mest komplette LH1-underenhed, ekstraher den og indlæs den i Coot, tilføj manuelt den manglende sekvens i den, og forfin manuelt hele strukturen, før du tilsætter to BCls a (BCL) og en spirilloxanthin (CRT) [i henhold til den relevante Rps. Densiteten af ​​LH1-komplekset og det kendte carotenoidindhold. Arter (17)]. Kopier den komplette LH1-underenhed, og brug UCSF Chimera "Docking Map Tool" til at docke det tilstødende ikke-modelområde med LH1-densitet, og forfin den derefter i Coot; gentag processen, indtil alle LH1-underenheder er modelleret. For RC-LH114-W-strukturen segmenteres proteinet fra de resterende ikke-proteinkomponenter i USCF Chimera-kortet ved at udtrække den ikke-allokerede tæthed i Coot, og Autobuild-værktøjet bruges til at etablere den oprindelige model og de resterende underenheder (protein-W). Modellering i PHENIX (49). Tilføj eventuelle manglende sekvenser til den resulterende model i Coot (48), og forfin derefter manuelt hele underenheden. Den resterende ikke-allokerede tæthed passer til kombinationen af ​​lipider (PDB monomerbiblioteks-ID for CDL = CDL, POPC = 6PL og POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) og UQ10-molekyler (U10). Brug PHENIX-optimering (49) og manuel optimering i Coot (48) til at perfektionere den komplette initialmodel, indtil modelstatistikken og den visuelle kvalitet af tilpasningen ikke kan forbedres yderligere. Brug endelig LocScale (50) til at skærpe det lokale kort, og udfør derefter flere andre cyklusser med modellering af den ikke-allokerede tæthed og automatisk og manuel optimering.
De respektive peptider, cofaktorer og andre lipider og quinoner, der er placeret inden for deres respektive tætheder, er vist i figur 1 og 2, S18 til S23. De statistiske oplysninger for den endelige model er vist i tabel S1.
Medmindre andet er angivet, blev UV/Vis/NIR-absorptionsspektrene indsamlet på et Cary60-spektrofotometer (Agilent, USA) med intervaller på 1 nm fra 250 nm til 1000 nm og en integrationstid på 0,1 sekunder.
Fortynd prøven i en kvartskuvette med en 2 mm strålelængde til en A880 på 1, og opsaml absorptionsspektret mellem 400 og 1000 nm. De cirkulære dikroiske spektre blev opsamlet på et Jasco 810 spektropolarimeter (Jasco, Japan) med intervaller på 1 nm mellem 400 nm og 950 nm ved en scanningshastighed på 20 nm min-1.
Den molære ekstinktionskoefficient bestemmes ved at fortynde kernekomplekset til en A880 på ca. 50. Fortynd 10 μl volumen i 990 μl bindingsbuffer eller methanol, og opsaml absorptionsspektret straks for at minimere BChl-nedbrydning. BChl-indholdet i hver methanolprøve blev beregnet ved ekstinktionskoefficienten ved 771 nm på 54,8 mM-1 cm-1, og ekstinktionskoefficienten blev bestemt (51). Divider den målte BChl-koncentration med 32 (RC-LH114-W) eller 36 (RC-LH116) for at bestemme kernekomplekskoncentrationen, som derefter bruges til at bestemme absorptionsspektret for den samme prøve, der er opsamlet i bufferen parallelt. Tre gentagne målinger blev taget for hver prøve, og den gennemsnitlige absorbans af BChl Qy-maksimummet blev brugt til beregning. Ekstinktionskoefficienten for RC-LH114-W målt ved 878 nm er 3280 ± 140 mM-1 cm-1, mens ekstinktionskoefficienten for RC-LH116 målt ved 880 nm er 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 blev kvantificeret i henhold til metoden i (52). Kort sagt blev omvendt fase HPLC (RP-HPLC) udført ved hjælp af Agilent 1200 HPLC-systemet. Opløs ca. 0,02 nmol RC-LH116 eller RC-LH114-W i 50 μl 50:50 methanol:chloroform indeholdende 0,02% (w/v) ferrichlorid, og injicér den præ-ækvilibrerede Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Dissolve i 1 ml-1 min-1 ved 40°C i HPLC-opløsningsmiddel (80:20 methanol:2-propanol) på en ×25 cm søjle. Udfør isokratisk eluering i et HPLC-opløsningsmiddel for at overvåge absorbansen ved 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoider) og 780 nm (BChl) i 1 time. Toppen i 275 nm kromatogrammet efter 25,5 minutter blev integreret, og indeholdt ikke andre detekterbare forbindelser. Det integrerede areal bruges til at beregne den molære mængde UQ10 ekstraheret med henvisning til kalibreringskurven beregnet ud fra injektion af rene standarder fra 0 til 5,8 nmol (figur S14). Hver prøve blev analyseret i tre replikater, og den rapporterede fejl svarer til standardafvigelsen (SD) af gennemsnittet.
En opløsning indeholdende RC-LH1-komplekset med en maksimal Qy-absorption på 0,1 blev fremstillet med 30 μM reduceret hestehjerte-cytokrom c2 (Merck, UK) og 0 til 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tre 1 ml prøver blev fremstillet ved hver UQ2-koncentration og inkuberet natten over i mørke ved 4°C for at sikre fuldstændig tilpasning til mørket før måling. Opløsningen blev fyldt i et OLIS RSM1000 modulært spektrofotometer udstyret med et 300 nm flamme/500 linjegitter, 1,24 mm indløb, 0,12 mm midterste og 0,6 mm udløbsspalter. Et 600 nm langt passfilter placeres ved indgangen til prøvefotorøret og referencefotomultiplikatorrøret for at udelukke excitationslys. Absorbansen blev overvåget ved 550 nm med en integrationstid på 0,15 s. Excitationslyset udsendes fra en 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) gennem et fiberoptisk kabel med 90% intensitet via en DC2200-controller (Thorlabs Ltd., UK) og udsendes til lyskilden i en vinkel på 90°. Målestrålen er rettet mod spejlet for at returnere lys, der ikke oprindeligt blev absorberet af prøven. Overvåg absorbansen i 10 sekunder før illuminansen på 50 sekunder. Derefter blev absorbansen yderligere overvåget i 60 sekunder i mørke for at vurdere, i hvilken grad quinolol spontant reducerer cytokrom c23+ (se figur S8 for rådata).
Dataene blev behandlet ved at tilpasse en lineær starthastighed inden for 0,5 til 10 s (afhængigt af UQ2-koncentrationen) og beregne gennemsnittet af hastighederne for alle tre prøver ved hver UQ2-koncentration. RC-LH1-koncentrationen beregnet ud fra den respektive ekstinktionskoefficient blev brugt til at omregne hastigheden til den katalytiske effektivitet, plottet i Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) og tilpasset Michaelis-Menten-modellen for at bestemme de tilsyneladende Km- og Kcat-værdier.
Til målinger af transient absorption blev RC-LH1-prøven fortyndet til ~2 μM i IMAC-buffer indeholdende 50 mM natriumascorbat (Merck, USA) og 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Ascorbinsyre anvendes som offerelektrondonor, og tert-butaclofen anvendes som QB-hæmmer for at sikre, at den primære RC-donor forbliver reduceret (dvs. ikke fotooxideret) gennem hele måleprocessen. Cirka 3 ml prøve tilsættes en specialfremstillet roterende celle (ca. 0,1 m i diameter, 350 RPM) med en optisk banelængde på 2 mm for at sikre, at prøven i laserbanen har tilstrækkelig tid til mørketilpasning mellem excitationspulser. Brug ~100-fs laserpulser til at forstærke Ti:Sapphire-lasersystemet (Spectra Physics, USA) for at excitere prøven ved 880 nm med en repetitionshastighed på 1 kHz (20 nJ for NIR eller 100 nJ for Vis). Før dataindsamling udsættes prøven for excitationslys i ca. 30 minutter. Eksponering vil forårsage QA-inaktivering (muligvis reduceret QA en eller to gange). Bemærk dog, at denne proces er reversibel, fordi RC efter en lang periode med mørketilpasning langsomt vil vende tilbage til QA-aktivitet. Et Helios-spektrometer (Ultrafast Systems, USA) blev brugt til at måle transiente spektre med en forsinkelsestid på -10 til 7000 ps. Brug Surface Xplorer-softwaren (Ultrafast Systems, USA) til at opdele datasættene, derefter flette og standardisere. Brug CarpetView-softwarepakken (Light Conversion Ltd., Litauen) til at bruge det kombinerede datasæt til at opnå differentialspektre relateret til henfald, eller brug en funktion, der konvolverer flere eksponenter med instrumentresponset for at tilpasse den spektrale udvikling med én bølgelængde i Origin (OriginLab, USA).
Som nævnt ovenfor (53) blev en fotosyntetisk film indeholdende LH1-komplekset, der manglede både RC- og perifer LH2-antenne, fremstillet. Membranen blev fortyndet i 20 mM tris (pH 8,0) og derefter fyldt i en kvartskuvette med en 2 mm optisk bane. En 30 nJ laserpuls blev brugt til at excitere prøven ved 540 nm med en forsinkelsestid på -10 til 7000 ps. Behandl datasættet som beskrevet for Rps. pal-prøven.
Membranen blev pelleteret ved centrifugering ved 150.000 RCF i 2 timer ved 4°C, og derefter blev dens absorbans ved 880 nm resuspenderet i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og 200 mM NaCl. Opløs membranen ved langsom omrøring i 2% (w/v) β-DDM i 1 time i mørke ved 4°C. Prøven blev fortyndet i 100 mM triethylammoniumcarbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) til en proteinkoncentration på 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyse). Yderligere bearbejdning blev udført fra den tidligere publicerede metode (54), startende med fortynding af 50 μg protein til i alt 50 μl TEAB indeholdende 1% (w/v) natriumlaurat (Merck, UK). Efter sonikering i 60 sekunder blev den reduceret med 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphin (Merck, UK) ved 37°C i 30 minutter. For S-alkylering inkuberes prøven med 10 mM methyl-S-methylthiomethansulfonat (Merck, UK) og tilsættes fra en 200 mM isopropanol-stamopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur. Proteolytisk fordøjelse blev udført ved at tilsætte 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C-blanding (Promega UK) og inkuberes ved 37°C i 3 timer. Laurat-surfaktanten blev ekstraheret ved at tilsætte 50 μl ethylacetat og 10 μl 10% (v/v) LC-kvalitet trifluoreddikesyre (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) og vortexe i 60 sekunder. Faseseparationen blev fremmet ved centrifugering ved 15.700 RCF i 5 minutter. I henhold til producentens protokol blev en C18-spinkolonne (Thermo Fisher Scientific, UK) anvendt til omhyggeligt at aspirere og afsalte den nedre fase, der indeholdt peptidet. Efter tørring ved vakuumcentrifugering blev prøven opløst i 0,5% TFA og 3% acetonitril, og 500 ng blev analyseret ved nanoflow RP-kromatografi koblet med massespektrometri ved hjælp af de tidligere beskrevne systemparametre.
Brug MaxQuant v.1.5.3.30 (56) til proteinidentifikation og kvantificering for at søge efter Rps. palustris proteomdatabasen (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Massespektrometriproteomikdataene er blevet deponeret i ProteomeXchange Alliance gennem PRIDE-partnerarkivet (http://proteomecentral.proteomexchange.org) under datasætidentifikatoren PXD020402.
Til analyse ved RPLC koblet med elektrosprayioniseringsmassespektrometri blev RC-LH1-komplekset fremstillet fra vildtype Rps. Ved hjælp af den tidligere publicerede metode (16) var proteinkoncentrationen produceret i palustris-celler 2 mg ml-1 i 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl og 0,03% (w/v) β-(Bio-Rad-analyse)) DDM. I henhold til producentens protokol anvendes et 2D-oprensningskit (GE Healthcare, USA) til at ekstrahere 10 μg protein ved udfældningsmetoden, og bundfaldet opløses i 20 μl 60% (v/v) myresyre (FA), 20% (v/v) acetonitril og 20% ​​(v/v) vand. Fem mikroliter blev analyseret ved RPLC (Dionex RSLC) koblet med massespektrometri (Maxis UHR-TOF, Bruker). Brug en MabPac 1,2×100 mm kolonne (Thermo Fisher Scientific, UK) til separation ved 60 °C og 100 μl/min-1 med en gradient på 85 % (v/v) opløsningsmiddel A [0,1 % (v/v) FA og 0,02 % (V/v) vandig TFA-opløsning] til 85 % (v/v) opløsningsmiddel B [0,1 % (v/v) FA og 0,02 % (v/v) i 90 % (v/v) acetonitril TFA]. Ved brug af en standard elektrospray-ioniseringskilde og standardparametre i mere end 60 minutter opnår massespektrometeret et værdi på 100 til 2750 m/z (masse-til-ladningsforhold). Ved hjælp af ExPASy bioinformatik-ressourceportalen FindPept-værktøjet (https://web.expasy.org/findpept/) kortlægges massespektret til kompleksets underenheder.
Cellerne blev dyrket i 72 timer under 100 ml NF-lav (10 μMm-2 s-1), medium (30 μMm-2 s-1) eller høj (300 μMm-2 s-1) lys. M22-medium (M22-medium hvor ammoniumsulfat er udeladt, og natriumsuccinat er erstattet af natriumacetat) i en 100 ml skruelågflaske (23). I fem 30-sekunders cyklusser blev 0,1 mikron glasperler tilsat i et volumenforhold på 1:1 for at lysere cellerne og afkølet på is i 5 minutter. Det uopløselige stof, ubrudte celler og glasperler blev fjernet ved centrifugering ved 16.000 RCF i 10 minutter i en bordmikrocentrifuge. Membranen blev separeret i en Ti 70.1 rotor med 100.000 RCF i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) med en 40/15% (w/w) sucrosegradient i 10 timer.
Som beskrevet i vores tidligere arbejde, immunodetektion af His-mærket på PufW (16). Kort sagt blev det oprensede kernekompleks (11,8 nM) eller membranen indeholdende den samme koncentration af RC (bestemt ved oxidation, subtraktion af det reducerede differensspektrum og matching af belastningen på den farvede gel) i 2x SDS-belastningsbuffer (Merck, UK) fortyndet to gange. Proteinerne blev separeret på en replika 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, UK). En gel blev farvet med Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) for at indlæse og visualisere RC-L-underenheden. Proteinet på den anden gel blev overført til en methanolaktiveret polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran (Thermo Fisher Scientific, UK) til immunoassay. PVDF-membranen blev blokeret i 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 og 5% (w/v) skummetmælkspulver og derefter inkuberet med det primære anti-His-antistof (i fortyndet antistofbuffer [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05% (v/v) Tween-20] i 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) i 4 timer. Efter vask 3 gange i 5 minutter i antistofbuffer blev membranen kombineret med peberrodsperoxidase (Sigma-Aldrich, Storbritannien) anti-mus sekundært antistof (fortyndet 1:10.000 i antistofbuffer). Inkuber for at tillade detektion (5 minutter efter 3 vaske i antistofbuffer) ved hjælp af WESTAR ETA C 2.0 kemiluminescenssubstrat (Cyanagen, Italien) og Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Storbritannien).
Ved at tegne intensitetsfordelingen af ​​hver farvet gel eller immunoassay-bane, integrere arealet under toppen og beregne intensitetsforholdet mellem RC-L (farvet gel) og Protein-W (immunoassay) i ImageJ (57) blev billedet behandlet. Disse forhold blev konverteret til molære forhold ved at antage, at forholdet mellem RC-L og protein-W i den rene RC-LH114-W-prøve var 1:1, og normalisere hele datasættet i overensstemmelse hermed.
For supplerende materiale til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-licensen. Artiklen tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie under forudsætning af, at det originale værk citeres korrekt.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at den ikke er spam. Vi indsamler ikke nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende, og til at forhindre automatisk spamindsendelse.
David J.K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Den højopløselige struktur af lysfælde 1-komplekset i reaktionscentret giver ny indsigt i kinondynamikken.
David J.K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Den højopløselige struktur af lysfælde 1-komplekset i reaktionscentret giver ny indsigt i kinondynamikken.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheder forbeholdes. AAAS er partner med HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.